[发明专利]梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法

摘要

梅毒螺旋体IgG抗体Dot‑ELISA检测方法，涉及梅毒特异性IgG抗体的检测。制备梅毒螺旋体特异性重组抗原；制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人γ链特异性片段单克隆抗体；抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；检测标本处理；加样；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体孵育；用磷酸盐缓冲液洗涤；显色；加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。快诊膜可延长已包被抗原的保存时间，实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性。应用斑点酶联免疫吸附法检测梅毒特异性IgG抗体不需特殊仪器，可实现大规模筛查，应用范围广，实用性强。

主权项

梅毒螺旋体IgG抗体Dot‑ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47。2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位；取抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，晾干后得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴燥处备用；3)以人γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人γ链单克隆抗体。4)采用过碘酸钠法进行抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育；6)在硝酸纤维素膜中加入磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；7)加入50μL步骤4)中的辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体,37℃孵育10min；8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；9)显色：加入3,3‑二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min，所述DAB显色剂按50mg DAB加入0.05mol/L Tris‑Hcl缓冲生理盐水100ml配制；10)加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；11)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。