[发明专利]一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒，该方法包括如下步骤：(A)使金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体与单链信号探针DNA杂交，形成DNA杂交链；(B)使该杂交链与待测样品中金黄色葡萄菌肠毒素A时，DNA杂交链与金黄色葡萄菌肠毒素A反应释放出单链信号探针DNA；(C)利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针DNA不水解而保留下来；(D)在单链信号探针DNA诱导下，银离子被维生素C还原生成近红外荧光银纳米簇；测定体系的荧光强度，从而测定待测样品中的金黄色葡萄菌肠毒素A的含量。

主权项

1.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：1）将各DNA储备液在95℃ 下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟，然后，分别取含3.0 μmol金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40 μL和3.0 μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40 μL 置于2ml 离心管中，在37℃下杂交1小时，生成金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体‑信号探针杂交物 Apt ‑ ssDNA；2）在37℃下，分别将浓度为0～50 ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素A添加到Apt‑ ssDNA溶液中，金黄色葡萄菌肠毒素A与金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体反应，生成核酸适体‑金黄色葡萄菌肠毒素A，释放出ssDNA；这时，体系中有ssDNA、剩余未反应的 Apt‑ ssDNA和核酸适体‑金黄色葡萄菌肠毒素A物质；所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’‑ AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC‑3’；3）加入10 μL 缓冲溶液，缓冲溶液组成为50 mM Tris‑HCl, 10 mM MgCl2，10 mM (NH4)2SO4,pH 7.5，然后加入10 mM dNTP 18 µL；再向体系中加入2µl 10 u/µl 的Phi29 DNA聚合酶, 在37℃下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体‑信号探针杂交序列 Apt‑ssDN 为模板扩增成双链DNA，在65℃下保持10分钟使Phi29 DNA去活；4）再向该反应体系中加入2μL 20 u/μL的Exo III核酸外切酶，在37℃下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；所述的单链信号探针ssDNA为5’‑CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG‑3’；5）向反应液中加入25 μL 1 mmol 硝酸银和10 mM，pH7.0的180μL PBS，然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为1 mM的新制备的抗坏血酸溶液，然后在45℃下反应5 ～10 min；6）将溶液转移至微量比色皿，以波长为585 nm的光为激发光，测定体系荧光发射 610‑800 nm 光谱，体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素A存在线性关系，其线性方程式为，y = 286.87 +96.12 C，相关系数r = 0.9988，线性范围0.002～0.20 ng/mL，检测限1 pg/mL，回收率在97.5～114.3%，其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素A的检测无干扰。