[发明专利]一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条

摘要

本发明公开了属于免疫学和食品安全检测领域的一种快速检测转CP4‑EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条。所述试纸条包括：PVC底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸。本发明采用的CP4‑EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130分别由杂交瘤细胞C1108和C1130分泌，其保藏编号分别为CGMCC No.11292与CGMCC No.11293。本发明的试纸条以胶体金标记的高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，检测的特异性强，灵敏度高，在5‑10分钟内即可判定检测结果；同时所述试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

主权项

1.一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：PVC底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；硝酸纤维素膜黏贴在PVC底板的中部，且硝酸纤维素膜上包被有相互分离的一条测试线和一条控制线；PVC底板一端黏贴样品垫和胶体金垫，另一端黏贴吸水滤纸；其中，胶体金垫位于硝酸纤维素膜靠近测试线的一端，压硝酸纤维素膜1-1.5mm，吸水滤纸位于硝酸纤维素膜靠近控制线的一端，压硝酸纤维素膜2-2.5mm；样品垫贴于胶体金垫的上方，露出胶体金垫2-3mm；所述的测试线为包被在硝酸纤维素膜上的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130的亲和常数为2.1×109M-1；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130由保藏号为CGMCC No.11293的杂交瘤细胞株分泌；所述的胶体金垫上包含用胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108的亲和常数为1.49×108M-1；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108由保藏号为CGMCC No.11292的杂交瘤细胞株分泌；所述胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108制备包括如下步骤：取90ml实验室三级水于洁净的圆底烧瓶中，加热沸腾后，加入4ml 1％的氯化金溶液，继续搅拌1min后，迅速加入6ml 1％的柠檬酸三钠溶液，形成混合溶液，混合溶液的颜色由浅黄变成黑色，最后变成酒红色，然后继续加热5min得到胶体金溶液；取100ml胶体金溶液，调节pH至7.0-8.0，加入15μg/ml C1108抗体，摇匀反应30min，加入终浓度0.1％酪蛋白钠，0.1％聚乙二醇20000封闭20min，4℃低温离心，10000rpm，30min，弃上清，用胶体金工作液复溶至原体积的50％，制成胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108；所述CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的制备包括如下步骤：用50μg纯化的CP4-EPSPS蛋白为免疫原，皮下多点注射BALB/C小白鼠，添加福氏完全佐剂；21天后进行第二次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；14天后进行第三次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；7天后进行ELISA效价检测，血清效价达1:243000；7天后进行细胞融合前加强免疫，用相同剂量的纯蛋白不加佐剂，脾脏注射；3天后取免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞进行融合；将免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例，在无血清RPMI-1640培养基中混匀，1400rpm离心5min，去除培养基，相同方法洗涤细胞三次；用50％的PEG3350作为融合剂，在37℃下，1min内缓慢加入1ml，搅拌1.5min，用14ml无血清RPMI-1640培养基终止融合后，4min缓慢滴加完成；800rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞与HAT培养基的细胞板中，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；培养6天后，用HAT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，筛选得到的阳性孔用HT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法进行复测，筛选阳性孔；筛选出的特异性强的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，共进行三次克隆，获得单抗杂交瘤细胞株C1108、C1130。