[发明专利]无毛模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法

摘要

本发明涉及一种突变位点可控的无毛模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法。本发明的无毛模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法利用CRISPR/Cas9和点突变技术，在Cas9在基因特定位点发生切割后，细胞会以同源重组方式利用提供的ssODNs为模板进行精确修复，通过CRISPR/Cas9和ssODNs设计可在基因特定位点引入终止密码子，使基因翻译提前终止，从而造成基因功能缺失。通过该方法可以精确复制人类疾病基因突变类型，从而避免由于基因突变方式不同而导致的表型差异。通过上述方法建立的无毛模型猪除毛发缺失，蹄子发育缺陷及舌丝状乳头发育缺陷外无其他异常，可用于各种皮肤病学研究和外用皮肤药、化妆品测试。其皮肤再经过免疫学改造，可用于临床皮肤移植。

主权项

一种无毛模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：针对猪HOXC13基因第一外显子396位及其上游和下游的部分碱基序列分别设计gRNA识别序列和点突变的ssODNs，其中，所述gRNA识别序列的互补序列与所述HOXC13基因第一外显子396位及其上游的部分碱基序列一致，所述ssODNs的碱基序列中与所述HOXC13基因第一外显子396位胞嘧啶对应的碱基为腺嘌呤且其他碱基序列与所述HOXC13基因第一外显子396位的上游和下游的部分碱基序列一致或为相应的同义突变序列；步骤二：对所述gRNA识别序列构建含有该gRNA识别序列的双链DNA；步骤三：构建含有步骤二中所述双链DNA的gRNA表达载体；步骤四：将所述gRNA表达载体、含有Cas9蛋白基因的表达载体以及所述ssODNs转染进猪胎儿成纤维细胞中，筛选出HOXC13基因敲除的阳性克隆细胞；步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞的卵周隙，形成重构卵。