[发明专利]基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法

摘要

本发明公开了一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法，其包括用来携带CAR基因的双链微载体，命名为CELiD^CAR；帮助微载体定点整合至人19号染色体AAVS1位点的质粒，命名为pCMV-Rep；载体体外共转染人T细胞的方法；T细胞体外筛选扩增的方法；定点整合CAR-T细胞的功能鉴定方法。本发明可实现CAR基因在T细胞内的定点整合于19号染色体AAVS1位点的人T细胞，改造过的人T细胞能够表达CAR受体，在体外激活试验中能够识别其特异性的抗原并激活T细胞，从而本发明能够极大的提高CAR-T细胞的安全性，具有潜在的临床应用价值。

主权项

一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)针对某一特异性肿瘤抗原，利用基因文库和PCR技术设计合成CAR基因；2)将步骤1)合成得到的所述CAR基因插入杆状病毒包装质粒pFastBacDual‑ITR‑NeoR中，构建得到质粒pFastBacDual‑ITR‑CAR‑NeoR；3)将步骤2)得到的质粒pFastBacDual‑ITR‑CAR‑NeoR利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统，在昆虫细胞Sf9中制备携带有CAR和NeoR的双链微载体CELiD^CAR载体；4)使用所述CELiD^CAR载体和pCMV‑Rep质粒共同电转染体外培养的人T细胞，将CAR基因定点整合到所述T细胞的19号染色体AAVS1位点；5)利用G418培养基体外药物筛选和扩增步骤4)中成功稳定转染CAR基因的T细胞，并对所述成功转染CAR基因的T细胞进行基因整合位点的鉴定、CAR受体表达鉴定以及CAR受体免疫激活功能鉴定；其中，所述pCMV‑Rep质粒的构建步骤为：使用PCR扩增AAV‑Rep，经Xba Ⅰ和BgI Ⅱ消化后连入质粒pCMV‑MCS，得到pCMV‑Rep。