[发明专利]一种从活性污泥中分离纯化蛭弧菌的方法

摘要

本发明公开了一种从活性污泥中分离纯化蛭弧菌的方法，通过关键的宿主菌筛选、活性污泥预处理技术，培养基及培养液的调配和培养条件的优化等技术步骤，借助自活性污泥中获得的革兰氏阴性细菌作为分离纯化蛭弧菌的宿主细菌，经过一系列关键步骤的优化从同源污泥样品中分离纯化出高效蛭弧菌。本发明不仅首次提出自市政污水处理厂活性污泥中成功分离高效蛭弧菌的方法，并显著缩短了其培养周期，克服了目前常规方法中蛭弧菌分离效果不稳定、培养周期长、操作繁琐等缺陷。

主权项

一种从活性污泥中分离纯化蛭弧菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）自污泥样品中筛选分离宿主菌及其菌悬液的制备：首先将市政污水处理厂二沉池的活性污泥作为污泥样品，从中分离筛选出革兰氏阴性菌，然后将所述革兰氏阴性菌作为宿主细菌，对其进行液体增殖18~24h后，经离心分离获取菌斑；最后对所获菌斑用无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到宿主菌悬液，将其在4℃下保存；2）对污泥样品进行预处理以获得蛭弧菌原液，具体流程为：将筛选宿主菌的同源污泥样品涡旋振荡30~60min，室温静置20~30min后，利用高速冷冻离心机在4~10℃、转速为800×g~1000×g条件下离心 15~25min，取上清液，然后将上清液在4~10℃、转速为15000×g~30000×g下离心20~30min，取沉淀，并用无菌磷酸盐缓冲液重悬，所获重悬液即为蛭弧菌原液；3）按照以下流程进行蛭弧菌的分离，然后对得到的混合液按照该流程至少重复进行三次纯化，得到纯蛭弧菌：首先采用稀释营养肉汤双层琼脂平板法进行蛭弧菌的分离，然后将分离得到的蛭弧菌加入到稀释营养肉汤培养液中，并向其中加入所述步骤1）得到的宿主菌悬液，其体积占稀释营养肉汤培养液的0.5%~1%，涡旋振荡混匀后，转移至25~30℃、150~200r/min的水浴恒温摇床中液增3~5天，将增殖液梯度稀释10⁵~10⁷倍，取各梯度稀释液与宿主菌悬液混合；4）纯蛭弧菌悬液的制备：将所述步骤3）得到的纯蛭弧菌的菌斑加入到无菌稀释营养肉汤培养液中，并向其中加入所述步骤1）得到的宿主菌悬液，其体积占稀释营养肉汤培养液的0.5%~1%，转移至25~30℃、150~200r/min的水浴恒温摇床中培养3~5天，所获得的增殖液即为纯蛭弧菌悬液。