[发明专利]产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺

摘要

产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺，涉及一种基因工程菌株的制备方法和发酵工艺。是要解决现有益生菌中蛋氨酸和赖氨酸含量较低，未能有效提高饲料蛋白转化率的技术问题。制备方法：一、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因片段；二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因片段；三、构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr重组载体；四、将重组载体pHT43/Zein转入纳豆芽孢杆菌；五、再转入pHT43/Cflr；即完成。发酵工艺：一、菌种活化；二、种子培养液制备；三、摇瓶发酵；四、发酵罐发酵；即完成。用于生产蛋氨酸和赖氨酸。

主权项

产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因Zein全长476bp片段；二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因Cflr全长720bp片段；三、利用枯草芽孢杆菌特异表达载体pHT43分别构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr基因重组载体；四、以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，将重组载体pHT43/Zein转入纳豆芽孢杆菌原生质体，然后于转化培养液中25℃培养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100μg/mL氨苄青霉素和5μg/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌落，于37℃培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Zein基因mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择Zein基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测蛋氨酸的含量，检测出蛋氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌；五、以步骤四获得的稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，然后将pHT43/Cflr转入纳豆芽孢杆菌原生质体，于转化培养液中25℃培养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100μg/mL氨苄青霉素和5μg/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌落，于37℃培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Cflr基因mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择Cflr基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测赖氨酸的含量，检测出赖氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳豆芽孢杆菌；步骤四和步骤五中荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：上游引物：5’‑GCGTGAGTGATGAAGGTTT‑3’，下游引物：5’‑GCCGTGGCTTTCTTGTTA‑3’；步骤四荧光定量PCR中检测Zein基因的引物序列为：上游引物：5’‑CCGTCTCGCAGATTAT‑3’，下游引物：5’‑GCAGCACCAACAAAGG‑3’；步骤五荧光定量PCR中检测Cflr基因的引物序列为：上游引物：5’‑GAAAGAAATGGTGGGAC‑3’，下游引物：5’‑CTACAGCAGCAACAGC‑3’。