[发明专利]一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法

摘要

一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析领域。本发明用灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种灭活病菌免疫8周龄BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选得6株产特异性单抗的杂交瘤细胞株。6株抗体分别标记HRP并以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌为目标物两两配对。以抗体1D3（CGMCCNo.9312单克隆细胞株Q号）和抗体6C6（CGMCCNo.9313单克隆细胞株R号）分别作为包被抗体和酶标抗体，建立了丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA法，LOD为1.5*10⁵cfu/mL。本发明的ELISA法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌特异性好，灵敏度高，成本低，可实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

主权项

一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法，其特征在于基于单克隆抗体的ELISA法，包被抗体为1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号，检测抗体为6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号；（1）丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌单克隆抗体的制备：以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌灭活菌体NCPPB1820做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠；经杂交瘤技术融合、筛选得到； （2）单克隆抗体的配对筛选：将纯化后的6株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×10⁸cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了6对P/N值>5的配对；（3）夹心法的建立：选择检测限稳定、灵敏的配对，即以1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号为包被抗体，6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：包被抗体1D3浓度：5μg/mL；包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液；标品稀释液：0.01M、pH7.2 PBS+0.2% Tween；酶标抗体6C6‑HRP浓度：2 μg/mL；反应时间：包被抗体：封闭37℃，反应2h；标准品：37℃，反应1h；酶标抗体37℃，反应1h；显色时间10min。