[发明专利]一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′‑脱氧腺苷的方法

摘要

本发明公开了一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′‑脱氧腺苷的方法，通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2′‑脱氧腺苷，具有工艺简单、转化率高、生产成本低、反应条件温和的优点，且副产物少，绿色无污染，产物易分离纯化。本发明中腺嘌呤转化率达到72.5％以上。另外，通过采用结晶及重结晶的方法分离纯化2′‑脱氧腺苷，使2′‑脱氧腺苷的纯度达到99％以上。

主权项

一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′‑脱氧腺苷的方法，其特征在于，将具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌接种产酶培养基进行发酵培养，将发酵培养得到的大肠埃希氏菌菌体作为催化反应的酶源与脱氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及缓冲液按照一定的比例混合组成反应混合物，并于温度50‑55℃下进行转化反应1‑2h，得到含有所述2′‑脱氧腺苷的生物转化液；此外，还包括以下步骤：步骤一、碱基去除，将所得生物转化液离心，得到去除大肠埃希氏菌菌体的上清液，调节所得上清液的pH值为6.5‑7.0后冷却静置15‑18h，去除所析出固体物质得到去除碱基的生物转化液；步骤二、结晶，调节所述去除碱基的生物转化液的pH值至10‑11后冷却静置6‑8h，分离所析出的固体物质得2′‑脱氧腺苷粗品；步骤三、重结晶，以30％乙醇溶液为溶剂，在60℃温度下将所得2′‑脱氧腺苷粗品进行溶解，溶解过程中不断搅拌，直至2′‑脱氧腺苷粗品不再溶解即制成2′‑脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，冷却至4℃静置6‑8h，2′‑脱氧腺苷重结晶，得到纯度为99.52％的所述2′‑脱氧腺苷纯品；其中，所述反应混合物中的缓冲液为浓度为45‑50mmol/L，pH值为6.5‑7.0的磷酸盐缓冲液；构成所述反应混合物的各组分的配比为：脱氧胸腺嘧啶核苷3‑5mmol，腺嘌呤3‑5mmol，大肠埃希氏菌菌体4‑10g及磷酸盐缓冲液100mL；所述大肠埃希氏菌为保藏编号是CGMCC No.8089的大肠埃希氏菌TH‑1；所述大肠埃希氏菌的发酵培养方法为：A、种子培养，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种接种于液体种子培养基中，于37℃摇床上培养40h，得到种子培养液，所述种子培养基组成为：酵母膏8.2g，蛋白胨14.1g，NaCl 7.3g及蒸馏水1000mL,121℃灭菌20min，pH值7.3；B、发酵培养，将种子培养液按照产酶培养基体积的7％的接种量接种于所述产酶培养基进行发酵培养，发酵培养温度为37℃，发酵培养时间10h，得到含有大肠埃希氏菌菌体的发酵培养液，产酶培养基组成为：牛肉膏12.6g，酵母膏13.8g，蛋白胨7.5g，NaCl 8.5g及蒸馏水1000mL,121℃灭菌20min，pH值7.5。