[发明专利]一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法

摘要

本发明涉及一种筛选保护或改善肾功能活性化合物的方法，该方法将能造成肾脏损伤的化合物与待测化合物共同作用于斑马鱼胚胎，或者先用肾毒性化合物作用于斑马鱼胚胎造成肾脏损伤然后再用待测化合物处理损伤后的胚胎，利用胚胎组织中的肌酐含量变化作为检测肾脏功能的指标，分析待测化合物是否具有保护或改善肾功能活性，建立一种具有快速、可靠、高通量特点的活性化合物的筛选方法，为肾脏疾病治疗药物的研究开发提供先导化合物。

主权项

一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含已知肾毒性化合物的培养水溶液中，培养20～28h，然后去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，制得损伤组胚胎；同时采用未加已知肾毒性化合物的培养水在相同条件下培养，制得正常组胚胎；将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含同一已知肾毒性化合物和待测化合物的培养水溶液中，培养20～28h，然后去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，制得治疗组胚胎；或者：将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含已知肾毒性化合物的培养水溶液中，培养20～28h，用纯水洗净胚胎表面残留液，然后将胚胎分为两组，一组移入培养水中，另一组移入含有待测化合物的培养水溶液中，将两组胚胎继续培养24h，去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，培养水培养的一组记为损伤组胚胎，含有待测化合物的培养水溶液培养的一组记为治疗组胚胎；采用培养水培养44～52h h，制得正常组胚胎；(2)向步骤(1)制得的每组胚胎加入同等体积的内标溶液，经匀浆、分层提取其中的极性组分，提取样品经氮吹干后，加入纯水溶解，然后过0.45μm聚醚砜水相滤膜，将滤液注入LC‑MS/MS，进行分离分析；然后分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液注入LC‑MS/MS，在相同条件下进行检测；(3)根据如下公式：C待测样品＝C标准品×AA待测样品/AA标准品式中：C为提取样品浓度，AA为色谱峰面积；计算待测样品中的肌酐及内标含量，再根据内标提取率计算各组胚胎样品中的肌酐含量；(4)各组胚胎组织中肌酐含量以均值±标准差表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性；当损伤组胚胎组织中的肌酐含量高于正常组胚胎组织中的肌酐含量，且达到统计学上的显著性水平，则成功造成胚胎肾脏功能损伤；在胚胎肾脏功能发生损伤前提下，当治疗组胚胎组织中肌酐含量低于损伤组胚胎组织中的肌酐含量，且达到统计学上的显著性水平，则待测化合物具有保护或改善肾脏功能的活性。