[发明专利]利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种利用L‑乳酸合成S‑1,2‑丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法。该方法，包括如下步骤：1)将大肠杆菌BW25113‑△poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA‑pta基因分别替换为3‑羟基丙酸脱氢酶的编码基因、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因和丙酰辅酶A转移酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO1；2)敲除所述BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到重组菌BWPDO2；3)向所述BWPDO2中导入丙酮酸脱羧酶的编码基因和NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因，得到重组菌BWPDO3，即为所述重组大肠杆菌。实验证明，本发明所得的重组大肠杆菌可以利用L‑乳酸转化生成S‑1,2‑丙二醇，以200mM乳酸钠为底物，37℃培养24小时可产生3.4mM的S‑1,2‑丙二醇。本发明为提高生物合成S‑1,2‑丙二醇的产量和转化率的工作打下了基础。

主权项

一种利用L‑乳酸合成S‑1,2‑丙二醇的重组大肠杆菌A的制备方法，包括如下(1)‑(3)的步骤：(1)将大肠杆菌BW25113‑△poxB中的lldD基因、adhE基因和ackA‑pta基因分别替换为3‑羟基丙酸脱氢酶的编码基因、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因和丙酰辅酶A转移酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO1；所述大肠杆菌BW25113‑△poxB为将大肠杆菌BW25113野生型中的poxB基因敲除后所得的菌株；所述3‑羟基丙酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列12；所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列13；所述丙酰辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列14；所述3‑羟基丙酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第116‑994位；所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2的第326‑1714位；所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第326‑1900位；所述poxB基因的核苷酸序列为序列表中序列18所示；所述lldD基因的核苷酸序列为序列表中序列5；所述adhE基因的核苷酸序列为序列表中序列6；所述ackA‑pta基因的核苷酸序列为序列表中序列7；所述大肠杆菌BW25113‑ΔpoxB是按照包括如下步骤的方法获得的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113野生型的感受态中转入序列表中序列17所示的DNA片段17，所述DNA片段17与所述大肠杆菌BW25113野生型的基因组发生同源重组，即实现敲除所述大肠杆菌BW25113野生型的所述poxB基因，获得所述大肠杆菌BW25113‑ΔpoxB；将所述大肠杆菌BW25113‑△poxB中的所述lldD基因替换为所述3‑羟基丙酸脱氢酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的感受态中转入序列表中序列1所示的DNA片段1，所述DNA片段1与所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述lldD基因替换为所述3‑羟基丙酸脱氢酶的编码基因；将所述大肠杆菌BW25113‑△poxB中的所述adhE基因替换为辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的感受态中转入序列表中序列2所示的DNA片段2，所述DNA片段2与所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述adhE基因替换为所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因；将所述大肠杆菌BW25113‑△poxB中的所述ackA‑pta基因替换为丙酰辅酶A转移酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的感受态中转入序列表中序列3所示的DNA片段3，所述DNA片段3与所述大肠杆菌BW25113‑△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述ackA‑pta基因替换为所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因；(2)敲除步骤(1)获得的BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到的重组菌记为BWPDO2；所述ldhA基因的核苷酸序列为序列表中序列8；所述dld基因的核苷酸序列为序列表中序列9；敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列10所示的DNA片段10，所述DNA片段10与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因；敲除所述BWPDO1的所述dld基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列11所示的DNA片段11，所述DNA片段11与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述dld基因；(3)向步骤(2)获得的BWPDO2中导入丙酮酸脱羧酶的编码基因和NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO3；所述BWPDO3即为所述重组大肠杆菌A；所述丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为序列表中序列15；所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列16；所述丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第1001‑2671位；所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第3‑953位；所述丙酮酸脱羧酶的编码基因和所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述BWPDO2中的；所述重组表达载体具体为将序列表中序列4所示DNA片段插入到pBAD43载体的多克隆位点后得到的重组质粒。