[发明专利]拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法

摘要

本发明涉及一种拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、筛选培养基配制、筛选培养和抗性苗检测。采用本发明的拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，培养容器和培养基都无需进行高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了拟南芥遗传转化后的培养环节，降低了拟南芥遗传转化后的培养成本；本发明的拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可，实用性强，推广性好；本发明的拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法与常规方法比较，可以降低成本10％以上。

主权项

一种拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、筛选培养基配制、筛选培养、抗性苗检测，其特征在于：(1)抑菌剂的配制：称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20％的次氯酸钠溶液100ml，加20g丙酸钙，再加成熟蒜头汁液20ml，用蒸馏水定容到200ml；(2)培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1‰～2‰的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；(3)农杆菌转化：选择携带HYG基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制备转化菌液；培植拟南芥植株，当侧苔形成1～2个角果时，将拟南芥植株的地上部分浸入转化菌液中，侵染20～40s，然后用薄膜覆盖，于黑暗处放置过夜后，揭开薄膜，继续培养拟南芥植株，当植株的角果枯黄、欲开裂时，收获种子，干燥条件下保存待用；(4)筛选培养基配制：筛选培养基为MS+30mg/L潮霉素+0.4～0.5ml/L抑菌剂+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先不加潮霉素和抑菌剂，按配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，冷却到40℃～50℃，然后，按培养基配方添加潮霉素和抑菌剂，混匀后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却凝固后备用；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；(5)筛选培养：将收获的种子，在10％的次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，用无菌水冲洗3次后，将拟南芥种子重悬于无菌水中，散播到筛选培养基上；4℃黑暗春化3d，然后在培养室温度为22℃～25℃，光照12h，光照强度为1200lx条件下培养；当获得的抑菌培养植株长出2片真叶时，移栽到土壤中，培养至成熟，单株收获种子；(6)抗性苗检测：取筛选后成活的抗性苗叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。