[发明专利]烟草遗传转化后的抑菌培养方法

摘要

本发明涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养和抗性苗检测。采用本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，培养容器和培养基都无需进行高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了烟草遗传转化后的培养环节，降低了烟草遗传转化后的培养成本；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可，实用性强，推广性好；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法与常规方法比较，可以降低成本10％以上。

主权项

一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养、抗性苗检测，其特征在于：(1)抑菌剂的配制：称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20％的次氯酸钠溶液100ml，加20g山梨酸钾，再加2g乳酸链球菌素，用蒸馏水定容到200ml；(2)培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1‰～2‰的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；(3)农杆菌转化：选择携带hyg基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制成转化菌液，用转化菌液侵染烟草叶片；(4)培养基配制：共培养培养基为MS+0.5mg/L BA+100μmol/L乙酰丁香酮+0.4～0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；筛选培养基为MS+0.1～0.5mg/L6‑BA+30mg/L潮霉素+0.4～0.5ml/L抑菌剂+300mg/L Timentin+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.4～0.5ml/L抑菌剂+300mg/L Timentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6‑BA，指6‑苄氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，等温度降到40～50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒处理的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；(5)共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至共培养培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3d；(6)筛选培养：将共培养后的材料移至筛选培养基中，培养室温度为28℃，光照12h，光照强度为1200lx；15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗；选取高于2cm的小苗转生根培养；(7)生根培养：将筛选培养获得高于2cm的小苗，分成单株接种至生根培养基中，20～30d可形成完整植株，即抑菌培养苗；培养室温度为28℃，光照12h，光照强度为1500lx；(8)抗性苗检测：取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。