[发明专利]一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛选方法

摘要

本发明提供一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤(1)、分离纯化获得海洋细菌；(2)、分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原；(3)、将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养；(4)、监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌。本发明的积极效果在以前研究的基础上，通过本发明，能大批量、迅速进行海洋细菌的筛选，并获得作用效果显著的对目的盾纤毛虫有明确杀灭作用的菌株，从而提高了应用微生物方法防治盾纤毛虫病的可能性，具有耗时短、提高效率、整个实验过程中无污染，可达到绿色环保的要求。

主权项

一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、分离纯化获得海洋细菌：取海洋生境来源样品，加入灭菌海水振荡混匀后，配制成10‑2，10‑3，10‑4，10‑5的稀释液，用上述稀释度的稀释液分别涂布100μl到改良海水2216E固体培养基平板上，每个稀释重复两次，用涂布好的培养皿倒置于25℃培养24‑96小时，挑取长出的单菌落，在海水2216E固体培养基平板进行划线，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24‑96小时，挑取长出的单菌落，再次在海水2216E固体培养基平板上进行划线，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24‑96小时，待单一菌落长出，挑取单菌落到1ml海水2216E液体培养基中，并用封口膜密封备用，接种好单菌落的海水2216E液体培养基置于25℃摇菌24‑96小时，至其OD600达到0.4‑0.7，用封口膜密封，为细菌菌液备用；(2)、分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原：将海水鱼类养殖厂取回患盾纤毛虫病的海水鱼，取其鳃部、大脑、体表病灶，做成水浸片用显微镜观察病灶部位，取发现有盾纤毛虫的病灶部位加入到5毫升灭菌海水中振荡，配制成10‑2，10‑3，10‑4，10‑5的稀释液，将上述稀释度的稀释液分别取10μl滴到无菌载玻片上，用显微镜观察每个水滴中盾纤毛虫的数量，对每个只存在一个盾纤毛虫的水滴立即转移到1ml鱼汤培养基中置于14‑18℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×103个/ml以上时，将该1ml鱼汤培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于14‑18℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×103个/ml以上，做为盾纤毛虫培养液备用；所述的鱼汤培养基配法为：取50ml陈海水，经过121℃，20min灭菌，冷却后加入1ml鱼肉汤母液；所述的鱼肉汤母液配制方法为：取大菱鲆鱼肉10‑30g于锥形瓶中，加入50ml的蒸馏水，电炉煮沸10min冷却，将上清液分装至灭好菌的1.5ml的离心管中，每管分装1ml，放置于‑20℃冰箱备用；(3)、将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养：取一个96孔板，96孔板的A1、B1孔做空白对照，加160μl灭菌海水，其余孔为实验组；取步骤(1)细菌菌液160μl加入到96孔板中，每种细菌设2个平行，即每一种细菌加两孔；取步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向96孔板加注了灭菌海水或细菌菌液的孔中再加注160μl盾纤毛虫培养液，将加好样的96孔板置于湿盒中，放到16℃共培养；(4)、监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌：开始共培养后，每隔1天，从培养箱中取出96孔板，将每孔液体吹匀后取出10μl‑20μl液体在显微镜下观察盾纤毛虫生长情况和存活率，液体中观察到活跃的盾纤毛虫个体少于10个，该细菌为有效菌，有效的细菌保藏留存。