[发明专利]一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法

摘要

本发明公开了一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，步骤（1）、置于冰冻人工脑脊液中；（2）、研磨前在研钵中倒入液氮预冷；（3）、将悬浊液在室温下静置；（4）、将上清液分装；（5）、在蛋白质团块中加RB；（6）、取5、10、15、20、25、30、35μg的BSA制作标准曲线；（7）、分析胶的上样量为银染；（8）、取出干胶条室温下复温；（9）、在等电聚焦盘中加入覆盖油；(10)、将等电聚焦处理；11）、取处理的胶条进行复温；（12）、用上槽液配置低熔点琼脂糖；（13）、取凝胶进行考马斯亮蓝染色，制图。方法易行，操作简便，适合大鼠海马组织蛋白样品的提取，获得蛋白点较多且清晰水平条纹，重复性较好的双向电泳图谱。

主权项

一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其步骤是：(1)将实验用SPF级大鼠处理后，置于冰冻人工脑脊液中1min，取脑组织，置于冰冻ACSF中30s，冰上分离出海马组织，同组内的海马称重；(2)大鼠海马组织的研磨前先在研钵中倒入液氮预冷，将步骤(1)处理的海马组织1g剪碎后置于研钵中，加入液氮，研钵中液氮不再沸腾后研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒；(3)将步骤(2)处理后的悬浊液在室温下静置1h，使蛋白溶解，在研钵中加入800μL裂解液，溶解粉末后转移至1.5mL EP管中，再加400μL LB涮一次研钵，转移到相同的EP管中，超声处理，破碎核酸，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液；(4)将步骤(3)处理后的上清液分装成4管，每管250μL，每管再加入1mL丙酮‑20℃沉淀过夜，沉淀完的蛋白质于4℃，12000r/min，离心20min，倒去上清液，打开管盖平放于干净的纸巾上自然干燥，得到处理后的蛋白质团块，‑80℃保存备用；(5)在步骤(4)处理后的每管蛋白质团块中加入200uL RB，用枪头将蛋白质团块戳小后吹打直至蛋白质分散，超声助溶，超声后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中；(6)取5、10、15、20、25、30、35μg的BSA制作标准曲线，取步骤(4)处理后的EP管中上清液2～3μL，每支管加入1mL Bradford进行染色，涡旋振荡20s，混匀后测定吸光值，测定两个样品之间的操作间隔是20s，定量分两次进行，第一次为初步定量，计算得到各样品的浓度，再进行第二次定量，为了定量的准确性，每次定量都制作标准曲线；(7)分析胶的上样量为银染100μg，质谱胶的上样量为1200μg，上样液的成分为：相应量的蛋白质、1％w/vDTT、1％v/vIPG Buffer、1×BPB、RB至460μL，根据步骤(6)中定量所得的浓度数据吸取相应量的蛋白质；(8)从冰箱取出干胶条室温下复温10min，水浴，23℃，步骤(7)中吸取的样本溶液均匀地加入槽底，加样长22cm，取出胶条，从酸性端开始，撕下覆盖膜，胶面朝下，酸性端朝顶端将胶条放入水化盘的槽中，放好胶条后再加入1.2mL覆盖油于支持膜上保湿，调节室内温度为20℃，让胶条泡胀过夜，记录下胶条的号码；(9)在等电聚焦盘中加入覆盖油，每条泳道加入6mL，取出步骤(8)处理后的胶条并吸干胶条上的覆盖油，胶面朝上将胶条放入等电聚焦盘中，剪好纸垫片，每个垫片加入75μL Milli Q水进行润湿，将纸垫片放胶面的两端，边缘与胶面边缘对齐，装上电极板，选择胶条数量后开始运行程序，一向等电聚焦程序为：S1stp 300V 0:30Hr；S2stp 700V 0:30Hr；S3stp 1500V 1:30Hr；S4grd 9000V 3:00Hr；S5stp 9000V 4:00Hr，整个聚焦过程所用总电压：52KVh，KVh为千伏小时，Vh，伏小时表示电压对作用时间的积分；(10)将步骤(9)等电聚焦处理完以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，‑20℃保存；(11)取出步骤(10)处理的胶条进行复温，水浴，23℃，加入10mL去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡，先加100mM DTT平衡15min，倒干净平衡液后加入250mM IAA平衡15min，IAA平衡时要避光；(12)用上槽液配置0.8％w/v的低熔点琼脂糖40mL，1.5％w/v的普通琼脂糖80mL，烧熔后放于泡沫盒中保温备用，倒掉玻璃板胶面上的液体，残留的液体用滤纸片吸干，吸取低熔琼脂糖封住整个胶面，取出步骤(11)中平衡后的胶条，接上电极后开始SDS‑PAGE电泳，BPB跑出二向胶以后停止电泳，二向电泳的程序为：S1 2W/gel 45min；S2 17W/gel，直到溴酚蓝跑到底，4:30h；(13)取出步骤(12)处理后的凝胶进行考马斯亮蓝G‑250染色，染色好凝胶放入透射扫描仪中扫描，制图，并用专用分析软件进行分析；步骤(3)的超声破碎处理程序如下：80W，0.8秒开，0.8秒关，超声10下后放于冰上冷却，再重复6次，破碎核酸，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液；所述的步骤(12)中二向SDS‑PAGE电泳灌胶液成分和含量如下：