[发明专利]一种以雌蕊为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法

摘要

本发明涉及植物快速繁殖技术领域，旨在提供一种以雌蕊为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法。该种方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养基配置、外植体接种及愈伤组织诱导、小植株再生、小植株的继代培养、小植株的出瓶种植。本发明突出具有污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高的特点，特别对于本发明以幼嫩花苞中的雌蕊为外植体，污染率可降低为0，可获得高达100%的愈伤诱导率，培养130天愈伤组织团块直径可达近1cm，愈伤团块再生率100%，胚性高，总体上每个雌蕊可获得10-40株小植株。

主权项

一种以雌蕊为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：材料采取：在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的花蕾，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；步骤二：愈伤诱导培养基配置：愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、0.25～1.5mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸（2,4‑dichlorophenoxyacetic，2,4‑D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境下存放；步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠（NaClO）溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾分开，将雌蕊从花蕾中剥离，切除柱头，将切除了柱头的雌蕊接种于步骤二中制作的盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，其中，雌蕊的接种以接触培养基表面为准；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养8～16天，出现愈伤组织团块；步骤四：小植株再生：外植体在愈伤诱导培养基上培养120天，部分愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织开始分化再生出完整的小植株，部分愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织仍保持脱分化状态；将外植体连同愈伤组织团块、小植株转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在完全黑暗条件下培养90～120天后，小植株大量分化，分化率95～100%，平均每个外植体上分化出10～40个小植株；在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基培养；小植株在继代培养基上生长4周后，可不出瓶，继续进行步骤五中的继代培养以维持百合离体鳞茎再生体系，再进行步骤六中的出瓶种植，每4周继代一次；也可直接进行步骤六中的出瓶种植；所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、0～0.2mg/Lα‑萘乙酸（1‑Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8；步骤五：小植株的继代培养：步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后，不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；步骤六：小植株的出瓶种植：出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质（如Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗专用介质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。