[发明专利]一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法

摘要

一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶（EC3.2.1.31）免疫7周龄BALB/c小鼠，经融合、筛选得10株单抗，分别标记HRP，并配对。以CGMCC No.7209为包被抗体和CGMCC No.7211为酶标抗体，以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为标准品建立夹心ELISA分析方法。本法通过裂解大肠杆菌ATCC25922检测胞内β-葡萄糖苷酸酶，实现大肠杆菌检测，LOD为3.27*10^4cfu/mL。本法首次制备了大肠杆菌的标志物β-葡萄糖苷酸酶的单抗并建立了检测大肠杆菌的双抗夹心法，本法与沙门氏菌、E.coli、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中大肠杆菌的检测提供了新的检测手段。

主权项

一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β‑葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，其特征在于     （1）单克隆抗体的制备以重组表达的大肠杆菌β‑葡萄糖苷酸酶为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到10个细胞株；重组表达的大肠杆菌β‑葡萄糖苷酸酶，购自爱尔兰Megazyme公司，货号120501；（2）单克隆抗体的配对筛选将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；以重组表达的大肠杆菌β‑葡萄糖苷酸酶为标品，浓度为10ng/mL；标品稀释液为pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释1000倍使用；在此条件下，实验成功得到了9对P/N值>5的配对；（3）夹心法的建立选择检测限稳定、灵敏的配对，即分别以10B6即细胞株9号CGMCC No.7209单抗为包被抗体和4F2即细胞株11号CGMCC No.7211单抗为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：抗体包被浓度：5μg/mL，包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS+0.1% Tween，检测抗体浓度：1.6μg/mL，反应时间：包被、封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；检测抗体：37℃、1h；显色10min；优化后大肠杆菌胞内β‑葡萄糖苷酸酶夹心法LOD：0.012ng/mL；（4）大肠杆菌裂解过程裂解液配制：0.1M磷酸盐缓冲液，0.01% Triton 100，0.05% EDTA，pH7.2；裂解过程：大肠杆菌经EC肉汤增菌，取增菌后的液体样品以液体样品︰裂解液体积比1︰9的比例加入到裂解液中，在室温下振荡15min，取100μL裂解后的样品进行大肠杆菌β‑葡萄糖苷酸酶夹心法检测；本方法检测大肠杆菌的LOD为3.27*10^4cfu/mL。