[发明专利]一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法

摘要

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，它包括6个步骤：细胞的铺板及培养、病毒的梯度稀释、病毒沉降剂的添加、病毒的接种及培养、免疫荧光检测和统计特异荧光孔的数目，并计算猪瘟病毒滴度。本发明为一种可精确评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力，且易于推广应用的IFA检测方法，能够对生产、运输各环节中的疫苗及半成品进行快速、精确检测，从而保证了疫苗的质量。与传统的兔体定型热反应法相比，具有省时，省力，直观，准确等优点。

主权项

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，它包括如下步骤：（1）细胞的铺板及培养以0.25%的EDTA‑胰酶将生长良好的检测用细胞进行消化分散，然后以细胞生长液重悬为细胞浓度2~4×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h，检测用细胞长满单层； （2）病毒的梯度稀释在10℃~15℃，用0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将猪瘟兔化弱毒活疫苗复溶，PBS加入量0.1ml/头份，并用0.01M的PBS进行梯度稀释；（3）病毒沉降剂的添加将无菌的病毒沉降剂聚乙二醇溶液按体积比1:1添加于各检测梯度病毒液中，混匀；（4）病毒的接种及培养将步骤（3）所述的添加了病毒沉降剂的各检测梯度病毒液接种于步骤（1）中的细胞培养板中，加入量100μl/孔，同时设置不接病毒液的细胞对照孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育2~3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱继续培养72h； （5）免疫荧光检测培养结束后，对细胞依次进行固定、封闭、孵育猪瘟病毒抗体（一抗）、孵育荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），而后在显微镜下进行荧光细胞观察；（6）统计特异荧光细胞孔的数目，并计算猪瘟病毒滴度特异荧光细胞孔（阳性孔）的判定标准为，培养孔中有特异荧光细胞即可；特异荧光细胞判定标准为，自然光下观察应为健康细胞，荧光下观察具有细胞形态。