[发明专利]一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法

摘要

发明公开了一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其步骤是取材与固定：剥去种皮，切割种子，将含种胚和部分胚乳的种尖部分浸入FAA固定液中固定24h以上；脱水：浓度70%乙醇中泡洗3～5次后从浓度70%乙醇开始梯度脱水；透明：二甲苯作透明剂进行5级透明；浸蜡与包埋：倒出1/2体积二甲苯，向瓶中加蜡屑至饱和，40℃过夜。之后每隔2h换一次蜡液，每天3次，重复3天后进行常规石蜡包埋；切片；展片及粘片：在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平；脱蜡、复水、番红固绿染色、透明；封片。本发明能够得到组织结构完整、清晰的芍药成熟种胚石蜡切片，从而为研究芍药种子休眠和萌发提供准确的技术支持。

主权项

一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其特征是：包括如下步骤：（1）取材和固定：a. 洗种子：用洗洁精清洗10～20min，流水冲洗干净；b. 种子的筛选：水选，浸种2～3h之后，去除上浮的不充实种子；c. 用浓度0.5%的高锰酸钾溶液对芍药种子进行40min消毒处理，用蒸馏水冲洗干净；d. 在恒温箱中，45℃温水浸种48h，使种皮软化，种子吸水；e. 去除上浮的不充实种子；f. 用吸水纸吸干种子表面的水分，用手术刀剥去种皮，将芍药种子切割成含有胚的种尖部分，迅速放入盛FAA固定液的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上；（2）脱水：将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h，然后更换无水乙醇再浸泡1h，对材料彻底脱水；（3）透明：脱水后的芍药成熟种胚依次入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各级浸泡透明2h，然后更换纯二甲苯浸泡1h，再次更换纯二甲苯浸泡30min；（4）浸蜡和包埋：透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蜡屑，直到饱和，放回恒温箱中，40℃过夜，青霉素瓶盖儿漏缝盖，让二甲苯慢慢蒸发；第二天早上，再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑，敞口放置于60℃恒温箱中，2h后把原溶液倾去，换熔融石蜡，熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡液，两者体积比1:1之后每2h换一次蜡液，每天3次，重复5天后进行常规石蜡包埋；（5）切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，采用旋转式手动切片机，切片厚度7～10μm；（6）展片及粘片：在洁净的载玻片上均匀涂上明胶，将蜡带光面小心地放在载玻片上，以水作漂浮剂，在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平，之后自然干燥；（7）脱蜡、复水、番红固绿染色、透明：将充分干燥的切片放入二甲苯中浸泡30min，之后换新的二甲苯再浸泡20min进行脱蜡；脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇及浓度95％、80％、70％、50％乙醇中各5min，于蒸馏水中浸洗2次；之后用浓度1%的番红进行过夜染色。番红染色后的切片经蒸馏水浸洗2遍后依次入浓度50％、70％、80％和95％乙醇中各5min进行脱水处理；之后用浓度0.5%的固绿染色30s，经两次无水乙醇透明，每次5min；切片依次入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液5min，二甲苯5min，二甲苯5min进行透明处理；（8）封片：切片从二甲苯中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。