[发明专利]一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种采用发根农杆菌遗传转化甜叶菊建立毛状根培养体系生产绿原酸及二咖啡酰奎宁酸的方法。内容包括甜叶菊外植体制备、发根农杆菌活化培养、悬浮培养及绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的生产。经PCR检测，证明甜叶菊毛状根为转化产生，HPLC检测表明甜叶菊毛状根能够生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸。由于所使用的毛状根具备在无激素培养基上快速生长的特性，因此该方法操作简单、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。为利用毛状根培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提供了一种稳定、可持续的新型药源和食品功能因子，为今后应用生物反应器进行绿原酸和二咖啡酰奎宁酸规模化生产提供可靠的来源和物质基础。

主权项

1.一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌侵染甜叶菊外植体，包括如下步骤：(1)人工去除甜叶菊种子上的冠毛，在20‑40℃水浴锅内保温1‑28小时，滤纸吸干，将甜叶菊种子用70％酒精消毒20‑60S，用无菌水冲洗2‑3次，再用0.1％的汞液消毒2‑20min，用无菌水冲洗5‑6次；接种在固体培养基上，该培养基配方为：MS基本培养基，10～60g/L蔗糖，0.01～1mg/LNAA和0～1mg/L BA，再添加7‑8g/L的琼脂粉；温度25±2℃条件下培养，黑暗培养10‑20d，然后移至光室，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，得到无菌苗；(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T‑DNA至甜叶菊叶片中，包括以下步骤：a.发根农杆菌接种在YEB培养基活化:将发根农杆菌接种于含利福平抗生素的YEB固体培养基，挑取单菌落，接种在含利福平抗生素YEB液体培养基中，温度28～30℃，转速50～400r/min，震荡过夜培养，再取活化后的菌液10‑500μL加入到10～50mL含Rif抗生素的YEB液体培养基中，温度28℃，50～400rpm震荡暗培养至OD值为0.5‑1.0；b.用发根农杆菌侵染甜叶菊无菌外植体：室温10000～5000rpm离心2‑20min，弃上清，菌体用等体积的1/2MS重悬浮，在25‑35℃，50‑200rpm震荡暗培养半小时，使菌液浓度达到OD600＝0.2‑1.5左右，用于侵染；c.发根农杆菌与甜叶菊外植体共培养：首先预培养，剪取培养在MS固体培养基上的甜叶菊无菌苗叶片和茎段外植体，接种到含有AS的MS培养基中，25℃暗培养2d；将经预培养的甜叶菊叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10min，轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触，取出浸染后的叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2‑6d；d.外植体在羧苄西林钠、头孢噻肟钠除菌培养：将共培养3d后的甜叶菊叶片用无菌水冲洗数次后用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于除菌培养基1/2MS+100‑500mg/LCb上除菌培养，7‑10天后，转接到1/2MS+400～600mg/L头孢噻腭钠上，在此期间，甜叶菊叶片的伤口处将会陆续出现白色毛状根；1‑2周后将其转接到1/2MS+100～300mg/L头孢噻腭钠上，1‑2周后再转到1/2MS+100～300mg/L头孢噻腭钠上，两周后基本除菌完毕后，转移至不含抗生素的1/2MS培养基上，培养条件为25±2℃，黑暗培养；(3)甜叶菊毛状根获得与继代培养：挑选除菌彻底、经过PCR检测的毛状根，将分枝多、生长快速的毛状根转移至1/2MS培养液中，进行继代培养；(4)甜叶菊毛状根的分子检测，方法如下：e.提取甜叶菊毛状根DNA；1)取幼嫩甜叶菊毛状根100‑200mg，加入液氮磨成粉末；2)将磨成粉末的甜叶菊毛状根装入1.5mlEppendorf的离心管中，加入600μl经60℃预热的2×CTAB以及10μl的巯基乙醇，混匀后置于60℃水浴锅中40‑50min，期间不时颠倒混匀；3)待裂解液冷却至室温后加入等体积苯酚，轻柔翻转混匀，静置10min；4)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；5)加入等体积酚：氯仿，酚：氯仿＝1：1，轻柔翻转混匀，静置10min；6)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；7)加入等体积氯仿，轻柔翻转混匀，静置10min；8)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；9)加入两倍体积遇冷的无水乙醇，析出絮状沉淀；10)用吸头将白色絮状沉淀挑到EP管中，75％乙醇清洗两次，烘干；11)加入无菌水充分溶解后再加入Rnase置于37℃水浴锅中30min，置于‑20℃中备用；f.获得含有rolB和rolC引物的PCR反应体系；g.PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；h.电泳检测目标条带；(5)甜叶菊毛状根中绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的含量检测；(6)甜叶菊毛状根中绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的提取和纯化，甜叶菊毛状根经干燥处理后，粉碎处理，加入1‑100倍的水，蒸煮提取2～3次，合并提取液，过滤，55‑80℃减压浓缩，调至pH2‑4，大孔树脂吸附，上柱吸附流速1‑6BV/h，之后用10‑80％的乙醇，pH6‑9，洗脱液流速1‑4BV/h，进行洗脱，洗脱体积为3‑8BV，减压浓缩回收，得到产品。