[发明专利]一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用

摘要

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法，并提供该方法的应用途径。适用于检测硫化氢合成酶包括CBS、CSE及CL的活性，对于组织样品，先剪成小块再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液进行裂解，裂解产物进行蛋白定量，如图，反应体系(组织细胞裂解产物、L‑半胱氨酸、5‑磷酸吡哆醛)加在反应瓶外圈的反应池中，吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)加在内圈的吸收池中，反应体系产生H2S气体分子与吸收体系的荧光探针相结合，可用于荧光测定和荧光成像，定量检测H2S含量，更为直观地反映H2S合成酶的活性。本发明可为研究H2S相关的信号通路以及H2S在一些疾病过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。

主权项

一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的方法，其特征是：(1)这种检测方法适用于检测CBS、CSE及CL的活性，其中CL需要另外加入亚硝酸盐，实验步骤如下：对于组织样品，先剪成小块，再研磨，对于细胞，使用中国南通碧云天生物技术所提供的组织细胞裂解液进行裂解；细胞裂解产物经蛋白定量后，加入反应瓶中，反应体系加在外圈的反应池中，包括2mmol/L的5‑磷酸吡哆醛400μl，使用的5‑磷酸吡哆醛MW＝265.1，10mmol/L L‑半胱氨酸40μl，使用的L‑半胱氨酸MW＝121.16，及组织细胞裂解液，并用100mmol/L、PH＝7.4的磷酸缓冲液定容至2ml；吸收体系加在内圈的吸收池中，即加入20μmol/L硫化氢荧光探针工作液1ml，其中含有10μmol/L的反应佐剂溴烷铵；在37℃的密闭环境中吸收反应60min，取吸收池的溶液可用于荧光测定和荧光成像；(2)检测硫化氢合成酶活性试验，本试验中的组织细胞的裂解方法为：用中国南通碧云天生物技术所提供的组织细胞裂解液进行裂解，对于55mm细胞培养皿加入100μl细胞裂解液即可；(3)检测硫化氢合成酶活性试验，本试验的吸收体系为：含有10μmol/L的反应佐剂溴烷铵的硫化氢荧光探针工作液，在37℃的密闭环境中吸收反应60min；(4)检测硫化氢合成酶活性试验，本试验中的检测方法为：取吸收池溶液，用美国AMG荧光显微镜进行荧光成像，或用型号为Varioskan Flash3001、最大激发波长λex＝476nm、最大发射波长λem＝513nm的全波长扫描多功能读数仪进行荧光测定，绘制H2S标准曲线可进行定量分析。