[发明专利]一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法，该方法将脂肪干细胞（ADSCs）诱导重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。具体包括如下步骤（1）将多能性因子的cDNA导入ADSCs；（2）在无饲养层体系中，使用无血清培养基培养步骤（1）得到的ADSCs；（3）出现胚胎干细胞（ESCs）样细胞克隆后，更换成添加有MEK与GSK3信号通路抑制剂的培养基继续培养，挑取细胞克隆并扩大培养；（4）鉴定细胞克隆的多能性。本发明中，ADSCs成本低且易于大量获取，重编程的速度与效率很高；无饲养层体系可以提高阳性iPSCs克隆的纯度；无血清培养基避免了血清中未明确组分与批次差异带来不稳定因素；信号通路抑制剂能够促进细胞达到充分重编程的状态，提高阳性iPSCs克隆的质量。

主权项

一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法，用于将来源于猪的脂肪干细胞（ADSCs）诱导重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），其特征在于，包括如下步骤：（1）将多能性因子的cDNA通过药物可诱导的RevTet‑On型表达载体导入ADSCs，其中所述的多能性因子为Oct4、Sox2、Klf4、c‑Myc基因；（2）在无饲养层体系中，使用无血清培养基或者加入代血清添加剂的培养基培养步骤（1）得到的ADSCs；所述无血清培养基还包含：40% DMEM/F‑12培养基、40% Neurobasal® 培养基、1% N‑2添加剂、1% B‑27添加剂、1% GlutaMAX®添加剂、0.1mM β‑巯基乙醇、1000U/mL 白血病抑制因子、2μg/mL 强力霉素；在培养皿上预先包被基质胶，将培养的ADSCs以2500个细胞/cm2的密度接种到培养皿上；（3）出现胚胎干细胞样细胞克隆后，在所述培养基中添加工作浓度为0.5μM的MEK信号通路抑制剂与工作浓度为3μM的GSK3信号通路抑制剂，继续培养3天，再挑取细胞克隆并扩大培养；以及（4） 鉴定细胞克隆的多能性，包括检测细胞的碱性磷酸酶活性、内源多能性基因的表达、胚胎干细胞（ESCs）标记物的表达、体内分化形成畸胎瘤的能力。