[发明专利]一种用于检测溴氰菊酯的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测农药溴氰菊酯的试剂盒，所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述试剂组包括浓缩PBS缓冲液、显色底物、浓缩洗涤液、终止液、溴氰菊酯标准溶液、溴氰菊酯酶标抗原，溴氰菊酯半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂，成本较高，分析速度较慢的问题，提供了简洁，快速，灵敏，准确的免疫分析技术。

主权项

1.一种用于检测溴氰菊酯的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述的试剂组包括：（1）浓缩PBS缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用双蒸水5倍稀释；（2）显色底物：四甲基联苯胺-双氧水溶液；（3）浓缩洗涤液：含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释；（4)终止液：1.25M的硫酸；（5）溴氰菊酯标准溶液：其溴氰菊酯标准溶液母液为1mg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到100μg/mL后，再按1:4稀释6个梯度；（6）溴氰菊酯酶标抗原：溴氰菊酯半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍；所述的包被板是将制备好的抗体溶于50mmol，pH9～10的碳酸缓冲液中，配制成10mg/ml的包被液，酶标板每孔加100μL包被液，常温静置12-16小时，再将包被好酶标板的每孔用吐温20的磷酸盐缓冲溶液0.05%（v/v）洗涤3次；酶标板每孔加入200μL，1%的BSA/PBS封闭液，封闭一小时，再将封闭好的酶标板的每孔用吐温20的磷酸盐缓冲溶液0.05%（v/v）洗液洗涤3次，冻干后真空包装，于4℃保存；上述使用的抗体采用如下步骤制得：免疫：免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行6次免疫，加强免疫分别在初次免疫后第2周，第4周和第6周进行三次，以后两次为一个月进行一次，从第3次免疫后开始采血测效价，采血时间为免疫后第10天；初次免疫：取1mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫；加强免疫：取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫；抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备IgG抗体；上述所述人工抗原采用如下方法制备：（1）合成6-氨基己酸甲酯反应式：称量400～410mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下搅拌，缓慢滴加氯化亚砜，至不溶物完全溶解后继续冰浴下搅拌30min～40min，减压下脱去溶剂后即得AME；（2）合成6-{[3-(2,2-二溴–乙烯基)-2,2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸甲酯反应式：称量二溴菊酸80～82mg溶解于装有6mL无水二氯甲烷中，冰浴搅拌反应30min；再依次加入1.0～2.0mgDMAP和69～72mgDCC，氮气保护下室温搅拌4～5h；加入43～44mgAME，搅拌，反应过夜；滤去反应液中沉淀，再经0.1mol/L盐酸，饱和碳酸氢钠，蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤，最后减压去除溶液，即得DAE；（3）合成6-{[3-(2,2-二溴–乙烯基)-2,2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸反应式：称取128～130mgDAE溶于装有1.62mL乙醇中，边搅拌边滴加2.3mL，2mol/LNaOH，加热回流3h，然后减压除去乙醇，用盐酸酸化至pH=3，液体固化，再加入氯仿使其溶解，然后用蒸馏水洗去所含少量乙醇，减压去除溶剂即得农药溴氰菊酯半抗原；（4）合成6-{[3-(2,2-二溴–乙烯基)-2,2-二甲基-环丙烷羰基]-氨基}-己酸-2,5-二氧吡咯烷-1-基酯反应式：称量72～73mgDA和25～26mgNHS溶于2.2mL无水THF，在氮气保护下加入45～46mgDCC；室温反应过夜；过滤，减压下脱去溶剂，即得农药溴氰菊酯半抗原的活化酯；(5)人工抗原的合成取上述方法合成的半抗原的活化酯1.6mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A，0.86mg血蓝蛋白用于2ml PH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲溶液中配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃下用pH=7.4的0.2mol/L磷酸缓冲溶液透析三天即可得到人工抗原；所述酶标抗原的制备方法是：取上述方法合成的半抗原活化酯1.9mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A，0.54mg辣根过氧化物酶溶于2ml pH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液中配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃下用pH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到酶标抗原，用于显色反应。