[发明专利]一种利用激流式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法

摘要

本发明提供了一种利用激流式生物反应器培养猪流行性腹泻病毒的方法，该方法充分发挥了激流式生物反应器的工艺优点，优选了适宜猪流行性腹泻病毒在宿主细胞内增殖的环境条件，填补了利用激流式生物反应器培养猪流行性腹泻病毒的技术空白。与现有技术相比，本发明的细胞培养过程逐日增大空气流量，加快系统内气体循环，有利于培养液内CO2的溢出，有利于细胞生长，进而利于病毒的增殖；同时本发明病毒的接种过程无需吸附，简化操作，节省人力；此外本发明使用的浓缩营养液，可以倍增多种氨基酸含量，为病毒繁殖提供了充足的营养，有利于提高病毒产量。

主权项

一种利用激流式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：1）制备制苗用细胞：将Vero‑E6细胞种子悬液和细胞生长液利用蠕动泵加入到激流式生物反应器的灌注袋中，使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体上，接种密度为每克载体接种6.0‑6.5×107个细胞，将设备参数设定为以下值，培养罐内液体环境温度：37‑38℃，培养罐加热膜温度：43‑45℃，灌注袋加热膜温度：35‑37℃，pH：7.2‑7.8，溶氧：35%‑65%，振荡速度45‑60r/min，初始空气流量100ml/min‑1000ml/min，每24小时空气流量增加100ml/min‑1000ml/min，开始培养，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，维持培养液残糖量1‑2g/L，培养一段时间得到制苗用细胞培养液；2）病毒接种与培养：当步骤1）所述制苗用细胞培养液单日耗糖量较前一日差值小于5%时，排空反应器内液体，将猪流行性腹泻病毒种毒与细胞维持液按照1:100‑3:100(v/v)的比例混合后通过蠕动泵泵入其中，将设备参数设定为以下值，培养罐内液体环境温度：35‑38℃，培养罐加热膜温度：37‑40℃，灌注袋加热膜温度：34‑38℃，pH：7.2‑7.8，溶氧：35%‑65%，振荡速度45～60r/min，空气流量400ml/min‑4000ml/min，开始培养，培养24h时后开始分别持续流加补充含2‑4倍浓缩的DMEM培养基和200g/L葡萄糖溶液，维持培养液残糖量1‑2g/L，培养40‑42h后，得到病毒培养液；3）病毒液收获：收获激流式生物反应器培养罐与灌注袋内的病毒培养液，将灌注袋反复冻融2‑3次后收获上清液，混合后‑20℃保存备用，即得到猪流行性腹泻病毒。