[发明专利]一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法

摘要

本发明公开一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，该方法为：从蔬菜叶上采集被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸，从虫尸上分离虫生真菌，放入PDA培养基上培养后制成孢子悬浮液喷于烟粉虱2龄若虫上，培养后从虫尸上再次分离该虫生真菌，保存在试管斜面上，保存于冰箱中。从冰箱中取出虫生真菌，制成孢子悬浮液，用滤纸片沾取孢子悬浮液，接种于培养基上，对置于霉菌培养箱中培养，挑取菌丝接入无菌水中搅拌，过滤，将孢子悬浮液，置于培养皿中心，在菌落中心打孔，吐温-80打散，搅拌，过滤后计算产孢量和菌落直径。用该方法对最适培养基配方、温度、pH、光照条件和通气条件进行筛选。本发明的优点在于菌落直径面积大，产孢量大。

主权项

一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述分离方法为：首先从温室蔬菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸3‑7头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经110‑130℃灭菌10‑30min后的去离子水5‑15ml冲洗2‑4次，放入马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上，倒置于20‑30℃霉菌培养箱中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上培养，8‑12d后马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有5‑15ml0.1%的吐温‑80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3‑5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温‑80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有40‑60头烟粉虱2龄若虫的蔬菜叶上，放入湿度为80‑100%，温度为20‑30℃的人工气候箱中培养4‑6d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于3‑5℃冰箱中；所述玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为：从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为5‑10的马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上，置于霉菌培养箱中培养8‑12d；在培养的前4‑6d设置霉菌培养箱的温度为15‑30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后4‑6d设置霉菌培养箱的温度为15‑30℃全黑暗培养，这样利于产孢；8‑12d后挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温‑80的无菌水中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3‑5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温‑80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液；再用直径4‑8mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径为9cm加入20‑30ml马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA的玻璃培养皿中心，先在温度为15‑30℃光照为24h全光照的条件下培养4‑6d，再转入温度为15‑30℃全黑暗的条件下培养4‑6d后，马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径为4‑8mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色，这时菌落 形成，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔4‑6处，且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温‑80打散，放在磁力搅拌器上搅拌20‑40min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。