[发明专利]枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法

摘要

本发明公开了枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。本发明的方法利用upp正负筛选系统，对枯草芽孢杆菌基因组进行无痕修饰。本发明的方法利用ComK表达系统，使枯草芽孢杆菌具有优异dsDNA转化效率，可达3～5×103cfu/μg dsDNA。同时利用了外源核酸内切酶I-SceI表达系统，将双链DNA断裂引入至基因组，显著提高了负筛选分子内基因重组效率，最高可达8×10-4。本发明的方法可以迭代修饰枯草芽孢杆菌基因组多个目的核酸序列，包括引入基因突变至基因组，从基因组中敲除目的基因序列以及大片段基因组序列删除等。

主权项

一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，其特征是包括如下步骤：（1）构建含有I‑SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I‑SceI表达质粒pEBS‑copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I‑SceI酶切识别位点；（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK；（3）将所述质粒pEBS‑copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK；（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR获得目标操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B；将所述含有DR序列的上游同源臂F、正负筛选盒子和含有DR序列的下游同源臂B通过融合PCR得到目的dsDNA片段1；（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段1转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK‑I；（6）将所述发生双交换基因重组的阳性转化子BUK‑I接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I‑SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK‑II。