[发明专利]铁皮石斛的茎尖组培繁殖方法

摘要

铁皮石斛的茎尖组培繁殖方法，属于中药材种植技术领域，包括引种灭菌、诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗和生根培养五大步骤；其有益效果是采用茎尖组培所得到的幼苗，其遗传性状稳定，有效物质含量与野生品种相近；同时本发明方法还大大缩短了铁皮石斛的组培繁殖周期，从剪切茎尖到生根苗的组培周期仅需5个月左右，大大缩短了生产时间，降低了生产成本。

主权项

铁皮石斛的茎尖组培繁殖方法，包括引种灭菌、诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗和生根培养五大步骤，其特征在于具体方法如下；⑴引种灭菌：选取健壮的野生铁皮石斛苗，从茎尖上切下长2.5～3.5cm的幼嫩茎尖，在流水下冲洗，放入1%洗洁精水溶液中浸泡5 分钟，然后用刷子轻轻刷洗，并用无菌水充分洗净；在超净工作台上将茎尖放置在75％的酒精中消毒30s后，再用0．1％的HgCl2水溶液浸泡7～9min，然后用无菌水冲洗5～6次；⑵诱导培养：将消毒处理后的幼嫩茎尖作为外植体接种在诱导培养基上，每瓶接种3～5株茎尖，在夜温22℃，日温24℃，相对湿度68%～70%，光照强度3000lx，每天光照开始时间上午7:00，每天光照时长12小时的条件下进行圆球茎诱导培养，15～20天后，外植体开始萌动，茎尖膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养15天后，转入到促形培养基中，每瓶培养2～4株茎尖，在夜温23℃，日温25℃，相对湿度70%～72%，光照强度3000lx，每天光照开始时间上午7:00，每天光照时长14小时的条件下进行圆球茎促形培养，25～30天后，切面及顶部膨大组织的表面逐渐形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的圆球茎颗粒物；⑶增殖培养：将诱导产生的生长状态良好的圆球茎转入到增殖培养基中，每瓶接种2～3颗，在夜温24℃，日温26℃，相对湿度70%～72%，光照强度2000lx，每天光照开始时间上午7:00，每天光照时长14小时的条件下进行圆球茎增殖培养，在15～20天之内可观察到增殖培养基中又有新的疏松组织产生，在35～40天之内，可观察到圆球茎增殖了2～3倍；⑷分化培养：将增殖产生的生长状态良好的圆球茎转接到分化培养基上，每瓶接种2～3颗，在夜温25℃，日温27℃，相对湿度72%～75%，光照强度3000lx，每天光照开始时间上午7:00，每天光照时长12小时的条件下进行分化培养，在20～25天之内可观察到圆球茎开始分化出芽点，然后将温度调整为夜温26℃，日温28℃，在第35～40天之内，可观察到圆球茎长出小芽并开始分叶，到第50天可看到增殖芽长高1‑1.5cm并带有2～3片小叶，得到分化苗；⑸壮苗及生根培养：将分化培养后的株高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上，每瓶接种3～5株，在夜温26℃，日温28℃，相对湿度72%～75%，光照强度2000lx，每天光照开始时间上午7:00，每天光照时长12小时的条件下进行生根培养，在第20～25天之内，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，每株苗有3～5条根，随后逐渐伸长，到在第35～40天之内，生根率达到90％以上，根须长度1.5cm～2.0cm，苗高3～5cm，即得到铁皮石斛的生根苗，这时可进行炼苗，移栽；上述组培繁殖方法中，所提到的各阶段培养基的配方是：诱导培养基：MS+6‑BA0.5mg／L+NAA0.05mg／L+20 g/L香蕉+30 g/L +活性炭0.2g／L；pH5.8；促形培养基：MS+6‑BA1.0mg／L+NAA0.1mg／L+20 g/L香蕉+30 g/L +活性炭0.2g／L；pH5.8；增殖培养基：DM+土豆40g/L+琼脂5g/L；pH5.8；分化培养基：DM+BA0.2‑0.8香蕉25g/L+琼脂5g/L+糖20 g/L；pH5.8；生根培养基：DM+BA0.5PPM+香蕉35g/L+琼脂5g/L+糖20 g/L；pH5.6。