[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I1C的纯化方法

摘要

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I1C的纯化方法。I1C蛋白为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB和ClfA两个抗原分子的活性功能片段重组融合、大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、盐析、GST亲和层析、PP酶切、Adhere层析、凝胶过滤层析等技术，获得高纯度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白I1C。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

主权项

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I1C的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）收集制备的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I1C；（2）高压破菌：将收集的可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I1C的大肠杆菌菌体以PBS(10‑20mM，pH7.0‑7.5)缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；（3）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000‑15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000‑15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；（4）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入10‑20mM Na2HPO4‑NaH2PO4、0.5M NaCl、2mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0‑7.5的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀10‑15分钟，10000‑15000g高速离心20分钟以上，收集上清；（5）GST亲和纯化：GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A(10‑20mM Na2HPO4‑NaH2PO4、10%甘油、5mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0‑7.5)缓冲液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；（6）Adhere层析纯化：步骤（5）收集的样品，使用A缓冲液平衡层析系统及Adhere层析柱，A缓冲液加1M NaCl，pH7.0‑7.5缓冲液线性梯度洗脱；（7）凝胶过滤层析纯化：将步骤（6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤层析柱纯化，采用A缓冲液平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。