[发明专利]一种沼泽红假单胞菌活菌制剂及其制备方法

摘要

本发明涉及一种沼泽红假单胞菌活菌制剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种沼泽红假单胞菌微生态制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括以下步骤：采用沼泽红假单胞菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为30~35℃的条件下培养96h左右，经过四级扩大培养后，用植物淀粉吸附发酵液并干燥，粉碎和包装，制成活性稳定的沼泽红假单胞菌制剂。本发明的优点：用普通的广口瓶、聚乙烯桶和聚乙烯薄膜袋即可完成沼泽红假单胞菌的大批量发酵，操作简单，效果稳定，能耗低，降低了生产成本，提高了生产效率，制成的沼泽红假单胞菌可以作为微生态制剂应用于畜禽养殖业。

主权项

一种沼泽红假单胞菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤：    （1） 菌种活化：     本发明采用沼泽红假单胞菌活菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM1.167，将‑80℃保存的沼泽红假单胞菌活菌菌种在种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g， MgSO4·7H2O 0.5g，无水CaCl2 0.3g，琼脂粉15g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）试管斜面上划线，光照强度3000~5000lx，30℃培养96个小时左右；    （2）制备一级种子：将活化的沼泽红假单胞菌活菌，用接种环挑取一环接种于20mL种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，无水CaCl2 0.3g，琼脂粉15g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）的试管中，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；    （3）制备二级种子：经过优化后的沼泽红假单胞菌液体发酵培养基配方：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH2PO4 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，经121℃、20min高温高压灭菌；在广口瓶中，以10~35%的比例接入一级种子液，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右；（4）三级大瓶培养：培养基：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH2PO4 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水或冷开水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，培养基加入透明聚乙烯桶内，以10~35%的比例接入二级种子液，保持温度为30~35℃，pH 6.0‑8.0，光照强度3000~5000lx，静置培养96个小时左右；（5）四级扩大培养：培养基：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH2PO4 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水、自来水、冷开水或者井水进行配制，pH 6.0~8.0，搅拌均匀，培养基加入10个聚乙烯薄膜袋（容量为5 L 、10L或者15L）；将储备的三级大瓶种培养液（活菌数3×109 CFU/mL 左右）作为母液，以10~35%的比例接种，再将聚乙烯薄膜袋内气体赶尽、封口；在遮阳网下面平铺进行培养，所有聚乙烯薄膜袋要避免阳光直晒，光照强度3000~10000lx，每天上午摇动聚乙烯薄膜袋一次，每次摇动10下，观察生长情况；在培养过程中，各聚乙烯薄膜袋内培养液的颜色变化均由淡黄、橙黄、浅红色到紫红色， 所不同的是紫红色的显现时间；（6）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为紫红色发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，经过粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。