[发明专利]赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用有效

专利信息
申请号: 201310224981.3 申请日: 2013-06-06
公开(公告)号: CN103320467A 公开(公告)日: 2013-09-25
发明(设计)人: 常有宏;唐娟;张保龙;刘廷利;杨郁文;陈天子 申请(专利权)人: 江苏省农业科学院
主分类号: C12N15/84 分类号: C12N15/84;A01H5/00
代理公司: 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 代理人: 张素卿
地址: 210014 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 发明涉及赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因及应用,属于生物技术领域。GrVe基因是从黑峰葡萄品种中获得的一个表面受体蛋白基因,该基因含有12个LRR保守结构域,C端有1个跨膜结构域。GrVe转基因表达株的黄萎病抗病性明显增强,不仅可以延迟发病,并且病指也大为降低。在病原菌接种后16,19,27天后,对于落叶型黄萎病V991,转基因株系黄萎病抗病性均明显增强。
搜索关键词: 赋予 植物 黄萎病 抗性 grve 基因 应用
【主权项】:
赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用,包括:1) GrVe基因的克隆以黑峰葡萄的cDNA模板,用引物P1: 5’‑ ATGTATCGAATCCTTTGCTTC‑3’,P2: 5’‑ CTAACTTCTTCTTGCTCCATG ‑3’扩增得到3006bp片段,将该片段命名为GrVe,登录号:XM_002263197,位置1‑3006,GrVe基因进行末端加A处理并与pGEM‑T easy载体连接,连接产物用JM109感受态细胞进行热激转化,测序后成功构建的质粒命名为pGEM‑T easy:GrVe;2)GrVe基因植物表达载体的构建根据基因序列,设计引物P3和P4,P3: ’‑GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGTTTCCTGTGGACATTGAC‑3’P4: ’‑GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGTCGCCGGGTTCTTCGC‑3以步骤1)以构建好的pGEM‑T easy:GrVe为模板进行扩增并回收,用TOPO法连接目的片段与Entry载体,经测序验证100%匹配,然后再将此载体与pK2GW7,0载体进行LR反应,转化大肠感菌DH5a,获得的阳性克隆即为含有pK2GW7,0载体和GrVe基因片段的重组载体,命名为pK2GW7,0:GrVe,经Hind III酶切验证正确,说明载体构建成功;3)转基因植株的获得将步骤2)中构建好的pK2GW7,0:GrVe提取质粒后,用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404,用叶盘法侵染转化本氏烟,将浸染好的烟草放在共培养基上,黑暗处培养2d,转换到筛选分化培养基上,每15d继代一次,至分化出的烟草长至3‑5cm时转至生根培养基中,根系发达后移到土壤培养;移栽后两周在其新叶上进行卡那筛选;PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达,用引物P5: 5’‑ATGGTCACATAAGCGGTTCAAAT‑3’ P6: 5’‑tcagacttgtcaactcccttgga‑3’扩增植株DNA进行PCR鉴定447bp大小片段,获得具有黄萎病抗性的阳性转基因植株。
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