[发明专利]一种富集分离单核增生李斯特菌的方法

摘要

本发明公开了富集分离单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes,Lm）的方法，更好地为目的菌进行后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括树状分子与抗体共价偶联、抗体修饰的树状分子再包被长链生物素分子、抗体和长链生物素共修饰的树状分子捕获样品液中的目的菌、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联样品液中的长链生物素化树状分子、被捕获细菌的分离及重悬等步骤；重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了样品中目的菌分离效率。

主权项

一种富集分离单核细胞增生李斯特菌Lm的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）每取1.0 mg树状分子溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N‑羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg乙基3‑（3‑二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg Lm特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状分子‑抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.53 mg步骤（1）所得树状分子‑抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素‑树状分子‑抗体复合物；（3）取1mL样品溶液，加入0.1 mg步骤（2）所得 Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子即生物素‑树状分子‑抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；（4）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有单核细胞增生李斯特菌的纳米磁珠‑链霉亲和素‑长链生物素‑树状分子‑抗体复合物。