[发明专利]一种临床级神经干细胞系的建立方法及用途

摘要

本发明属于细胞生物学、神经生物学领域，提供一种临床级神经干细胞系的建立方法及其用途，该方法在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，通过该方法建立的神经干细胞系，经鉴定说明，能表达多种干细胞标志物，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，具有非常好的稳定性，适宜于长期培养，可获得大量足够的临床级神经干细胞，本方法不仅可以从多个神经干细胞，更可以从单个神经干细胞建立神经干细胞系，尽可能减少研究误差。采用本发明方法建立的神经干细胞系及其分化所得的细胞，能够有效解决对神经系统疾病进行细胞治疗中存在的安全性和有效性风险，使得安全有效治疗这些疾病成为可能。

主权项

一种临床级神经干细胞系的建立方法，在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，其特征在于，所述神经干细胞传代培养具体再包括以下步骤：1).半量换液及收集神经干细胞条件培养基：当神经干细胞原代培养的半数神经球直径超过150μm时，竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞原代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；2).预处理：在神经干细胞传代前一天，向新的细胞培养瓶中加入适量神经干细胞条件培养基，备用；3).当培养神经干细胞的半数神经球直径超过200μm时，将神经干细胞及培养基收集到50ml离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；再将神经干细胞球重悬于神经干细胞消化液中，置于37℃培养箱消化10分钟，待可见细胞球略微松散时，加入胰酶抑制剂终止消化，采用巴斯德吸管将细胞轻轻吹打分散；4).离心收集细胞，离心条件为1300转/分钟，5分钟；5).取出前一天采用神经干细胞条件培养基预处理的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基；6).将神经干细胞传代培养基与神经干细胞条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶；7).将传代后的神经干细胞置于细胞培养箱中培养；8).换液：传代3～5天后，进行半量换液：竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞传代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；9).重复按步骤2)‑8)方法进行神经干细胞的传代并培养，建立稳定的神经干 细胞系。