[发明专利]一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒

摘要

本发明公开了一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒。所述的试剂盒由自然样品核酸粗提试剂、5×NASBA Buffer、5×Primer mix、4×Enzyme mix、RNA变性剂和杂交液12种成份组成。该检测试剂盒的检测原理是以藻细胞的rRNA为靶序列，采用一种等温核酸扩增技术制备靶序列，通过RNA的反向斑点杂交对多个检测样品进行同时检测。试剂盒的检测过程只需简易的设备，检测快速，检测结果可通过肉眼直接进行判断，且具有较高的灵敏度，可用于日常水环境的现场检测，对东海原甲藻赤潮的预警有一定的实用价值。

主权项

一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒，其特征在于，其组成为：（1） 试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为：2% (m/v) CTAB, 0.5%(v/v) β‑mercaptoethanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris‑Cl, 10 U RNase Inhibitor；（2） 试剂B为5×NASBA Buffer，其组成为0.2 M Tris‑HCl, 60 mM MgCl2, 0.35 M KCl2, 25 mM DTT, 20 mM dNTP；（3）试剂C为NTP（10 mM each)；（4）试剂D为5×Primer mix，其组成为：75% DMSO, 1 µM NASBA‑P1, 1 µM NASBA‑P2, 25 mM DTT, 20 mM dNTP；（5）试剂E为4×Enzyme mix，其组成为：1.5 M山梨醇, 0.42 mg/ml BSA, 16 U/ml RNase H, 6400 U/ml T7 RNA Polymerase, 1280 U/ml RT‑M‑MLV, 4000 U/ml RNA inhibitor；（6）试剂F为RNA变性剂，其组成为：1.5 M NaCl，0.15 M二水柠檬酸三钠，pH 7.0, 0.15 M 甲醛；（7）试剂G为杂交液，其组成为：1% Blocking Reagent II，0.75 M NaCl，0.075二水柠檬酸三钠，50 μg/mlml 鲑精DNA；（8）试剂H为地高辛标（DIG）标记探针，2 ng/μl，探针序列： 5’‑GCACGGCATACCTTCTAAGAG‑3’；（9）试剂I为Buffer II，其组成为：1% Blocking Reagent II, 0.1 M Tris, 0.15 NaCl, pH 7.5；（10）试剂J为碱性磷酸酶标记的DIG抗体(AP‑抗DIG)；（11）试剂K为显色剂，其组成为2.81% NBT，2.19% BCIP，70%二甲基甲酰胺；（12）对照模板：（12.1）阳性对照检测样品：东海原甲藻的总RNA；（12.2）阴性对照检测样品：赤潮异湾藻的总RNA。