[发明专利]一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其包括以下步骤：取自同一患者的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织和正常皮下纤维组织细胞分别经原代培养和传代培养后，于相同的培养液中在支架组织上进行体外共同培养，然后移植于裸鼠背部皮下，以建立肿瘤的活体组织模型。该方法运用组织工程学的方法和技术建立了人涎腺多形性腺瘤活体组织模型，为研究人涎腺多形性腺瘤的发病机制及探讨各种创新治疗方法，提供了研究基础，同时也为其他类型的良性肿瘤的活体组织模型的建立提供了可供借鉴的方法和思路。

主权项

一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其特征是，包括以下步骤：（1）材料与试剂的制备：培养液Ⅰ：取少量RPMI‑1640培养液，加入15‑20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPMI‑1640补至100ml；培养液Ⅱ：取少量RPMI‑1640培养液，加入5‑10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPMI‑1640补至100ml；培养液Ⅲ：取少量RPMI‑1640培养液，加入15‑20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、0.25g透明质酸，混匀，加RPMI‑1640补至100ml；处理液Ⅰ：取少量RPMI‑1640培养液，加入10‑15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U链霉素，混匀，加RPMI‑1640补足至100ml；处理液Ⅱ：取少量RPMI‑1640培养液，加入15‑20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、1g透明质酸，混匀，加RPMI‑1640补至100ml；选择脱细胞真皮基质、胶原凝胶、胶原海绵或聚乳酸中的一种作为支架材料，所述支架材料以缓冲液清洗2‑4次，于所述处理液Ⅱ中浸泡7‑14天后，在0‑4℃温度下保存，得到经处理的支架材料；（2）原代培养：（2‑1）涎腺多形性腺瘤细胞原代培养：患者手术取下的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织，于所述处理液Ⅰ中浸泡处理，取肿瘤组织块，清洗2‑3次之后，于所述培养液Ⅰ中切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，培养瓶于CO2培养箱中倒置，使组织块贴附于培养瓶底部，2小时后将培养瓶放正，加入所述培养液Ⅰ，在CO2培养箱中继续培养，24小时后更换所述培养液Ⅰ，此后每隔1天定期更换一次所述培养液Ⅰ，18‑22天后，得到原代培养的肿瘤细胞；（2‑2）皮下纤维组织细胞原代培养：来自同一患者的正常皮下纤维组织，于所述处理液Ⅰ中浸泡处理，然后进行清洗，切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，加入所述培养液Ⅱ后，于CO2培养箱中培养，24小时后更换所述培养液Ⅱ，此后每隔3天定期更换一次培养液Ⅱ，15‑19天后，得到原代培养的成纤维细胞；（3）传代培养：（3‑1）涎腺多形性腺瘤细胞传代培养：所得到的原代培养的肿瘤细胞，弃去培养液，以缓冲液清洗2‑3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液Ⅰ终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液Ⅰ稀释，然后按1∶3‑4的比例分瓶后加入培养液Ⅰ，置于CO2培养箱中进行培养，每隔1天更换所述培养液Ⅰ一次，进行肿瘤细胞传代培养；在传代培养过程中，采用反复贴壁法去除肿瘤细胞中的成纤维细胞；（3‑2）成纤维细胞传代培养：所得到的原代培养的成纤维细胞，弃去培养液，以缓冲液清洗2‑3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液Ⅱ终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液Ⅱ稀释，然后按1∶3‑4的比例分瓶后加入所述培养液Ⅱ，置于CO2培养箱中培养，每隔2天更换所述培养液Ⅱ一次，进行成纤维细胞传代培养；（4）体外共同培养：（4‑1）将对数生长期的传代培养的肿瘤细胞制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为1×106个/ml，取1ml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于经处理的支架材料中央，于CO2培养箱中孵育，1小时后加入所述培养液Ⅲ，在CO2培养箱中进行体外培养，每8小时更换所述培养液Ⅲ一次，连续进行3‑5天体外培养，得到肿瘤细胞支架组织；（4‑2）将对数生长期的传代培养的成纤维细胞制成单细胞悬液，调整成纤维细胞浓度为1×106个/ml，取0.5ml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于所述肿瘤细胞支架组织中央，加入所述培养液Ⅲ，在CO2培养箱中进行体外共同培养，每8小时更换所述培养液Ⅲ一次，连续进行7‑10天体外共同培养，得到共同培养的支架组织；（5）移植：在对共同培养的支架组织进行组织学鉴定确认后，将共同培养的支架组织作为移植物移植入裸鼠背部皮下，连续饲养3‑6个月后，建立组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型。