[发明专利]一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法

摘要

本发明公开一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）TSV病毒组织的获得；（2）TSV病毒检测；（3）TSV病毒液的制备；（4）构建TSV感染模型。通过本发明的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。

主权项

一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）TSV病毒组织的获得：将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射10~12μL，注射后对虾养殖水温控制在28‑30℃，盐度28‰，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；（2）TSV病毒检测：用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物：5′‑TCAATGAGAGCTTGGTCC‑3′，下游引物：5′‑AAGTAGACAGCCGCGCTT‑3′；（3）TSV病毒液的制备：取2~5g TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12~30ml的0.01M 的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g 离心15min，将上层清液用0.45μm的滤器过滤，利用步骤（2）所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，‑80℃冻存备用；（4）构建TSV感染模型：将TSV病毒液按10‑(n‑2), 10‑(n‑1)， 10‑n，10‑(n+1)，10‑(n+2)共5个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d，既而确定感染量，确定病毒感染模型。