[发明专利]一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法

摘要

本发明属于卷烟烟气凝集物毒性细胞效应检测技术领域，具体涉及一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法。现有技术不能充分的反映其烟气凝集物的生物学毒性。为解决现有技术存在的问题，本发明提供的技术方案是：本发明在常规细胞培养技术下，以哺乳动物气管上皮细胞或肺上皮细胞为靶细胞，以烟气凝集物为待测样品，两者共育一定时间，以MTT法检测受试靶细胞增殖状态，反映待测样品是否刺激靶细胞增殖，以细胞增殖的多少反映待测样品的生物学活性，即“毒性”，本发明对细胞毒试验是一个有用的补充，即检测烟气凝集物对靶细胞增殖的刺激作用。这种细胞增殖刺激作用比直接的细胞毒作用更灵敏。

主权项

一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法，其特征在于，包括以下步骤：1）烟气粒相物的获得：确定所要选用及需处理的样品，在恒温恒湿，即：20℃和60%相对湿度条件下平衡48h，通过德国Borgwaldt公司生产的 RM‑ 20型转盘式20孔道吸烟机，在维持20℃和60%相对湿度条件下，在标准抽吸条件下，即：1 puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff抽吸，烟气通过 85 mm直径的剑桥滤片收集；2）烟气粒相物的提取：将获得的滤纸片取下密封保存，处理时，用剪刀剪碎，放入50 mL离心管中，加入二甲基亚砜以使其完全浸没滤纸碎片，30℃下振荡4hrs后,  30℃，5000rpm条件下离心，取上清液体，收集入离心管中4℃密封保存备用；3）细胞增殖/细胞毒试验：细胞株：CCL‑64 貂肺上皮细胞，细胞培养于DMEM完全培养基中，经时添加培养基并传代，维持细胞在对数生长期，待用；取培养至对数期的细胞株，调细胞浓度至1x105 /ml, 接种于96孔板，104/孔细胞，添加待试的TPM 20% 起始，对倍稀释，37℃ 培养48小时，加MTT，即储存液2mg/ml，20μl/孔，继续孵育4小时， 弃上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm 读取光密度，分析结果，一般结果显示，高浓度烟气凝集物表现为直接的细胞毒效应，即OD值低于阴性对照，当待测样品浓度降低时则表现为刺激细胞增殖，OD值高于阴性对照，以明显刺激细胞增殖的最高稀释度为观察终点。