[发明专利]一种制备苹果树腐烂病菌转化子及GFP标记菌株的方法

摘要

本发明的目的在于提供一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法。该方法将含有二元载体的根癌农杆菌与腐烂病菌的分生孢子悬浮液混合后共培养，用抗生素筛选，获得转化子。该方法以苹果树腐烂病菌的分生孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，克服了苹果树腐烂病菌原生质体制备困难，且聚乙二醇(PEG)介导的转化效率低等原因导致的腐烂病菌遗传转化困难的问题。该方法的转化效率可达1/103个分生孢子。本发明同时提供了一种苹果树腐烂病菌绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株及其制备方法，该方法获得的转化子，表达强的绿色荧光蛋白的效率可达96.7%。

主权项

一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.制备苹果树腐烂病菌分生孢子：（1）将苹果树腐烂病菌接种于PDA培养基上，活化培养3天；（2）将活化培养的腐烂病菌打取菌饼接种于含有大麦粒的PDA培养基上，25℃恒温培养20‑30天，至橘黄色分生孢子角溢出；B.培养农杆菌：（1）将质粒pBIG3C转入农杆菌中；（2）取步骤B（1）中的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养1天；（3）取步骤B（2）中的农杆菌菌液于含卡那霉素的基本培养基中，28℃震荡培养2天，测量菌液的OD600值；（4）用含有乙酰丁香酮和2‑（N‑吗啉基）乙磺酸钠的IM培养基稀释步骤B（3）中的农杆菌悬浮液至OD600值为0.15，继续在28℃条件下振荡培养6h备用；C.根癌农杆菌与苹果树腐烂病菌分生孢子共培养：（1）取步骤A（2）中的苹果树腐烂病菌分生孢子角至步骤B（4）中的农杆菌悬浮液中，用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节浓度至106个分生孢子/mL；（2）将步骤C（1）中的农杆菌‑腐烂病菌分生孢子混合液，按200μL/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的含有乙酰丁香酮和2‑（N‑吗啉基）乙磺酸钠的Co‑IM培养基上，置于25℃共培养3~5天；D.转化子的筛选及保存（1）将步骤C（2）中的玻璃纸放于一空的无菌培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养3~5天；（2）将长出的腐烂病菌菌落转移至含有潮霉素的PDA平板中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到苹果树腐烂病菌转化子；（3）将得到的转化子保存在含有50μg/mL潮霉素的PDA斜面培养基上，置于4℃低温保存。