[发明专利]一种基于计算机分子模拟技术的拟除虫菊酯类的半抗原设计和应用

摘要

一种基于计算机分子模拟技术的拟除虫菊酯类的半抗原设计和应用，属于拟除虫菊酯类农药的检测技术领域。本发明设计了6种可能的半抗原。利用Gaussian软件计算半抗原和目标物的电荷分布；利用DiscoveryStudio2.5软件构建半抗原和目标物空间构象，通过比较，选择结构相似程度最高的半抗原为免疫半抗原（hapten1）；预测该半抗原能产生良好的免疫效果。选择结构差异较大的为包被半抗原(hapten5)。本方法成功地运用计算机分子模拟软件对拟除虫菊酯类农药半抗原进行了设计，通过合成免疫原和免疫，血清筛选，融合，筛选和亚克，实现识别拟除虫菊酯类农药群选性抗体的制备，证明该法具有节约时间和资金，很强的预测能力，为以后免疫学的分析研究提供了一种新方法。

主权项

1.一种II型拟除虫菊酯农药通用半抗原的设计方法，其特征在于根据拟除虫菊酯类农药的分子结构，设计了6种半抗原：半抗原（Hapten）结构式：，，，，，，（1）计算每个半抗原分子中原子的电荷性质及每个半抗原分子的空间结构，将半抗原分子和目标分子的总电荷性质，空间结构进行比较，选出免疫半抗原和包被半抗原；（a）利用Gaussian软件计算每个半抗原分子的电荷性质和带电量；（b）利用Discovery Studio 2.5构建各个半抗原和拟除虫菊酯类农药的三维分子，打开Discovery Studio 2.5，从View菜单下，打开Toolbars，选择Sketching；打开一个分子显示窗口Molecule Window，File>new>Molecule Window；然后在此窗口构建化合物的 3D 空间构象；（c）将半抗原和目标分子的总电荷性质，空间构象进行比较，选择半抗原的空间构象和电荷分布最接近的目标物，为最有可能产生免疫效果的半抗原Hapten1即为免疫半抗原；二者差异比较大的Hapten5被选为包被半抗原；（2）免疫原制备：以血蓝蛋白KLH为载体蛋白，采用EDC法碳二亚胺法合成免疫原：称取0.05mmoL的Hapten1，再加入DMF 1.0mL，溶解得到A液；称取0.1mmoL的EDC和0.12mmoL的NHS加到A液中，室温反应12h，得到B液；量取5.0mg/mL的血蓝蛋白KLH 16mL，冰浴中反应6h，4℃透析72h，换透析液6-8次，鉴定，分装，-20℃冻存，备用；（3）包被原制备：以牛血清白蛋白BSA为载体蛋白，采用重氮化法合成包被原：称取0.02mmol的半抗原5，滴入几点乙醇溶解，溶于1mol/L、0.6mL盐酸中，得到A’液；在冰浴搅拌下，加入0.2mol/L、0.15mL的 NaNO₃溶液中反应1h，称取BSA 27mg，溶于pH 9.6、5mL碳酸盐缓冲溶液中，为B’液；然后在冰浴搅拌下，将A’液逐滴加到B’液中，滴加完毕，反应3h；4℃透析72h，其间换透析液6-8次，鉴定，分装，-20℃冻存，备用；（4）单克隆抗体的制备：免疫8周龄BALB/c雌性小鼠6只，按常规方法制备得到单克隆抗体；（5）抗体灵敏度的测定：采用间接竞争酶联免疫吸附法进行测定。