[发明专利]桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法

摘要

桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，步骤包括：桑树无菌苗培养；外植体预培养；转基因侵染菌液制备；侵染与共培养；外植体除菌培养；桑树转基因毛状根的培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，繁殖结束。该方法可省去桑树愈伤细胞再分化的步骤，克服了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长，转化效率偏低等问题；转基因毛状根诱导和繁殖不受外界环境、季节和桑树花性等因素制约，大大提高桑树转基因效率；转入的MaERF1转录因子基因有助于桑树逆境胁迫下的应答机制及次生代谢物质的研究；本发明对桑树功能基因鉴定和研究及分子育种具有重大意义，具有广阔的开发应用前景。

主权项

桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤包括：（1）桑树无菌苗培养：取桑树种子，或剪取野外生长的桑树顶芽，清洗消毒后置于MS培养基，26℃‑28℃生长，培养一个月后得到桑树无菌苗，剪取无菌苗顶部叶片或茎段作为外植体；（2）外植体预培养：将上述外植体置于事先配制的预培养基上培养36‑48h；（3）转基因侵染菌液制备：高保真酶扩增目的基因桑树乙烯转录因子MaERF1，将获得的目的片段与真核表达载体pBI121‑eGFP连接后，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC158341感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基扩增至OD600=0.5时，添加乙酰丁香酮（AS），作为转基因侵染菌液；（4）侵染与共培养：上述预培养的外植体置于转基因侵染液中浸染5‑10min后，取出滤纸吸干，置于MS+50‑300μMAS的共培养培养基中，26℃‑28℃共培养36‑48h；（5）外植体除菌培养：共培养结束后，将外植体用无菌水清洗后转移至外植体除菌培养基MS+500mg/L头孢霉素+0.1％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+50‑300μM AS，一星期后再转移至MS+250mg/L头孢霉素+0.1％PVP+50‑300μMAS，直到侵染15天后出现桑树毛状根；（6）桑树转基因毛状根的培养：剪取长度1cm的毛状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素除菌培养基，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入添加0‑1.0mg/L吲哚乙酸的B5固体培养基扩大培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加0‑1.0mg/L吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，繁殖结束。