[发明专利]一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

摘要

一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病免疫检测领域。本发明提供一种基于检测抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的肝吸虫感染检测试剂盒及检测方法，可以区分肝吸虫感染患者与非肝吸虫感染患者。本试剂盒以肝吸虫抗原特异性IgG4为检测靶标，提高肝吸虫病检测方法的特异性；采用生物素-亲和素信号放大系统，可以增强酶联免疫检测方法的信号强度，提高了肝吸虫病检测方法的敏感性。与常规检测总IgG方法相比，本发明具有更好的特异性、敏感性与检测效能，有更好的临床应用价值。

主权项

一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，其特征在于由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1），酶标条（1）为96孔微孔板，浓度为1μg/孔；生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；显色液A（4），5mL×1瓶，市售品；显色液B（5），5mL×1瓶，市售品；肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），100μL×1瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为1μg/mL；肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7），100μL×1瓶，纯化的健康人IgG，浓度为1μg/mL；样品稀释液（8），12mL×1瓶，含2%BSA的PBST；抗体稀释液（9），25mL×1瓶，含2%BSA的PBST；浓缩洗涤液（10），50mL×1瓶，工作浓度为1︰20稀释；反应终止液（11），6mL×1瓶，2M H2SO4；和外包装盒与说明书（12）组成；所述肝吸虫成虫抗原的制备：将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清；用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF至终浓度为1mM，置于‑80℃冰箱，反复冻融后超声破碎后，4℃条件下高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原，分装后于‑ 80℃保存备用；包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1）的制备：用pH9.6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成0.5‑10μg/mL的溶液，按每孔100μL的量包被酶标条，4℃放置过夜后，将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，再用牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，倒去封闭液后用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干，4℃储存备用；生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2）的制备：（a）将分泌抗人IgG4单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠体内，产生腹水；（b）收集腹水，采用Protean A亲和层析法纯化抗人IgG4特异性单克隆抗体；（c）将单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得到生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3）的制备：（d）辣根过氧化物酶HRP在过碘酸钠NaIO4作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化学试剂；（e）加链亲和素Streptavidin，HRP醛基与链亲和素的氨基共价结合，形成Streptavidin‑HRP结合物；显色液A（4）为市售品；显色液B（5）为市售品； 肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值大于0.5；肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7）：由纯化的粪检确定为非肝吸虫感染的健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值小于0.1；样品稀释液（8）为含有牛血清白蛋白、Tween‑20的磷酸缓冲液；抗体稀释液（9）为含有牛血清白蛋白、Tween‑20的磷酸缓冲液；浓缩洗涤液（10）为含Tween‑20的磷酸缓冲液；反应终止液（11）为硫酸。