[发明专利]老鸦瓣无性快繁体系的建立方法

摘要

发明公开了一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，包括步骤：准备外植体、外植体消毒、初代诱导、诱导愈伤组织、生成不定芽、丛生芽增殖和壮苗、诱导具鳞茎试管苗、诱导试管鳞茎。本发明以冷藏芯芽为初始外植体，利用产生的中间繁殖体材料芽茎和鳞芽，分别经愈伤组织途径和器官发生途径获得丛生芽；可以通过愈伤组织和芽的循环增殖来提高老鸦瓣的繁殖系数；得到带根的基部膨大试管苗和试管鳞茎，有利于提高移栽成活率、提高耐贮藏、耐运输能力和缩短繁殖周期，且方法简单，成本较低，适宜于生产应用，对实现老鸦瓣的可持续利用具有重要意义。

主权项

一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体准备采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗消毒，于0～2℃进行湿沙冷藏层积处理，3.5～4.5个月取出作为外植体；(2)外植体消毒除去外植体绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分；(3)初代诱导将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中培养，1～2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为：光照1500‑3000lx，温度22±1℃，光照时间8‑16h/d，湿度70％～80％；(4)诱导愈伤组织、生成不定芽将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30～50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1～2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2‑3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为：含6‑BA 0.5‑1.0mg·L‑1、NAA1.0‑2.0mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6‑BA 0.2‑1.0mg·L‑1、NAA 0.5‑2.0mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑7的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6‑BA1.0‑2.0mg·L‑1、NAA 0‑0.5mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基；或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽 诱导培养基为：含6‑BA 0.5‑2.0mg·L‑1、NAA 0.01‑0.5mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基；(5)增殖和壮苗将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；所述不定芽增殖培养基为：含6‑BA 0.2～1.0mg·L‑1、NAA 0‑0.2mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基；所述壮苗培养基为：含6‑BA0‑0.2mg·L‑1、NAA 0‑0.2mg·L‑1、蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7·L‑1、pH5‑6的MS培养基；(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g·L‑1、琼脂5‑7g·L‑1、pH5‑6的MS培养基中培养，1.5～2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5～2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；(7)诱导试管鳞茎将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于3‑6℃暗处理1‑3个月后，转入含30‑90g·L‑1蔗糖的无激素MS培养基中，于温度22‑24℃、光照8‑16h/d条件培养2‑3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。