[发明专利]利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法

摘要

本发明公开了一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，包括以下步骤：A1、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；A3、转化菌液的准备；A4、外源基因的浸染转化；A5、抗性芽筛选和再生；A6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。本发明具有培育周期短、效率高、成本低、对菊苣本身重要农艺性状影响小等优点,该技术将加速我国菊苣品种培育的进程。该技术通过提高菊苣含硫氨基酸含量，降低饲料成本，实现优质饲料的绿色无公害生产，为畜牧业发展和人们生活提供充足的绿色蛋白质原料来源，应用前景广阔。

主权项

一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；A3、转化菌液的准备：用无菌牙签或接种针挑取含有外源基因质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种到50 mL 含有硫酸链霉素(Str, 50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液体YMB培养基中，28℃振荡培养16～24h至对数生长期，将培养物于4000~5000 r/min 离心10 min ，去除上清液，收集菌体，用1/2MS无菌液体培养基重悬沉淀至OD600=0.4Abs，用于侵染转化；或直接用1/2MS无菌液体培养基稀释菌液用于侵染；所述YMB培养基：0.5g/L K2HPO4＋0.2g/L MgSO4·7H2O＋0.5g/L NaCl＋10g/LMannitol ＋0.4g/LYeast extract，pH7.5；A4、外源基因的浸染转化：无菌条件下，选取生长状态良好的预培养外植体放入制备好的菌液中，使叶片外植体与菌液充分接触，并放于震荡培养箱上震荡浸染10min；浸染完后取出外植体，用灭菌滤纸吸去叶片表面附着的多余菌液，接种到垫有一层无菌滤纸且添加有乙酰丁香酮（AS，100umol/L）的共培养基上，于黑暗中共培养2‑3d到肉眼有可见微菌落；共培养完后，将外植体接种到与预培养相同的培养基上进行恢复培养1‑2d；所述共培养培养基为：MS基本培养基+6‑BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L+AS 100μmol/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.4～5.8；A5、抗性芽筛选和再生：恢复培养后，将转化外植体转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，25mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，500 mg/L）的筛选培养基中筛选培养直到长出抗性芽，当抗性芽长到1cm时，转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，15mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的扩繁培养基中扩繁至芽长到2‑3cm，再转入含筛选剂潮霉素（Hyg，10mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的生根培养基中进行 生根培养，直到长成完整的小植株；所述筛选培养基为：MS基本培养基+2.0mg/L6‑BA ＋0.2mg/LIBA+0.01mg/L TDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH5.8～6.0；扩繁培养基：MS基本培养基+2.0mg/L 6‑BA＋0.2mg/LIBA+0.01mg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH5.8～6.0；生根培养基为：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+蔗糖15g/L+8g/L琼脂，pH5.8‑6.0；A6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。