[发明专利]重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种重组猪α干扰素，通过以下方法制备：A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成；A2：构建重组真核表达载体pGAPZα-IFNα；A3：真核细胞酵母表达系统高效表达IFNα。将工程菌大量培养并表达的猪a干扰素，取上清液用层析柱纯化后，收集目标蛋白洗脱液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，采用细胞病变抑制法测定活性，按50％病变计算效价单位。测定用的细胞为牛肾细胞MDBK，攻击病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本发明将纯化获得的猪a干扰素应用于防治猪巨嗜细胞病毒病，实验证明对猪巨嗜细胞病毒感染细胞具有明显的保护作用。其用药途径通过注射给药或粘膜给药，剂型为注射剂或滴鼻剂。

主权项

一种重组猪α干扰素，其特征在于，通过以下方法制备：A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成：将天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1‑69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点序列及保护碱基。将基因中第24位氨基酸的三联体密码子的第3个碱基进行点突变，即将TGC突变为TGT；第29位氨基酸的第2个碱基进行点突变，即将ACC突变为ATC；第48位氨基酸的第3个碱基进行点突变，即将TCC突变为TCT；第101位氨基酸的第1个碱基进行点突变，即将GAT突变为AAT；第132位氨基酸的第3个碱基进行点突变，将ACG突变为ACC；第158位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由AAC突变为AGC；第161位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由CTC突变为CCC；第167位氨基酸的第1个碱基进行点突变，由ATC变为GTC；第174位氨基酸的第1和第2个碱基进行点突变，由GTC突变为TCC；第179位氨基酸的第2个碱基进行点突变，由ACA突变为AGA，突变后的基因序列编码的氨基酸未改变猪天然IFN α的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率；A2：构建重组真核表达载体pGAPZα‑IFNα：将克隆得到的IFNα基因，连接到PGM‑T载体上，转化大肠杆菌DH5α，得到PGM‑T‑IFNα；将PGM‑T‑IFNα和pGAPZα载体分别酶切后进行连接得pGAPZα‑IFNα，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌株，质粒经双酶切后得到了与理论大小一致的载体片段和干扰素目的片段；A3：真核细胞酵母表达系统高效表达IFNα：将上述重组表达载体pGAPZα‑IFNα经线性化后电转化受体菌GS115，经筛选得到阳性克隆，28度培养，使IFNα进行表达，经SDS‑PAGE凝胶电泳分析，分子量19.4KD，与理论值相符，将发酵上清液用层析柱进行纯化收集。