[发明专利]一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法

摘要

一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，属于海水动物增殖放流领域，包括以下步骤：选择中国对虾多个亲本，将雌雄亲本一对一定向交尾，交尾成功的雌虾在眼柄套上标记环后越冬培育，雄虾眼柄标记后放置在-70℃备用，交尾雌虾翌年进行苗种培育，放流季节对所培育的中国对虾幼苗进行放流；秋季，在洄游点捕捞取样，样品回捕后通过中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；本发明用于回捕个体的检测方法是中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，利用分子指纹图谱分析，从回捕样品中识别放流个体，该标记为个体遗传物质，不会对标记个体造成任何内在或物理损伤，可以准确评估中国对虾的放流效果。

主权项

一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特征在于包括以下步骤：选择确定遗传背景、不携带特定病原的中国对虾多个亲本，将雌雄亲本一对一定向交尾，交尾成功的雌虾在眼柄套上标记环后越冬培育，雄虾眼柄标记后放置在‑70℃备用，交尾雌虾翌年进行苗种培育，放流季节对所培育的中国对虾幼苗进行放流；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；所述的中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，微卫星引物组合及序列如下：EN0033正向序列为：5′‑CCTTGACACGGCATTGATTGG‑3′，反向序列为：5′‑TACGTTGTGCAAACGCCA AGC‑3′；RS0622正向序列为：5′‑TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG‑3′，反向序列为：5′‑CACATGCCTTTGTGTGAAAACG‑3′；FCKR002正向序列为：5′‑CTCAACCCTCACCTCAGGAACA‑3′，反向序列为：5′‑AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC‑3′；FCKR013正向序列为：5′‑GCACATATAAGCACAAACGCTC‑3′，反向序列为：5′‑CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT‑3′；PCR反应体系为：25μl反应体系，其中包括2.5μl 10×PCR缓冲液、四种荧光标记引物的浓度均为10μM，EN0033正反引物每条各为0.25μl，RS0622正反引物每条各为0.5μl，FCKR002正反引物每条各为0.5μl，FCKR013正反引物每条各为0.5μl；100ng基因组DNA、250μmol/L dNTPs、2.0mmol/L Mg2+、1单位Taq DNA聚合酶；扩增程序为：94℃变性4min后进行循环1：94℃变性40s，70℃退火1min， 之后每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环5次；随后进行循环2：94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共循环8次；再进行循环3：94℃变性40s，64℃退火1min，之后每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环4次；进行循环4：94℃变性40s，61℃退火1min，72℃延伸1min，共循环12次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。