[发明专利]白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法

摘要

白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，它涉及白蚁内源木质纤维酶重组杆状病毒的构建方法。本发明的目的是为了解决现有白蚁内源木质纤维酶的蛋白表达很难保证具有原始活性的问题。本发明利用PCR获得白蚁内源纤维素酶EG基因片段，连入pMD18-T，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得重组质粒p18EG1，经PCR及酶切鉴定，将EG基因片段转入pFastBack1质粒中，转化筛选后获得pFBEG1重组质粒，转染昆虫细胞后，即得。本发明最大程度接近白蚁自身内源木质纤维酶的表达环境，为提高表达产物活性提供最佳条件，从而找到高效、低成本的转化木质纤维的酶系。

主权项

白蚁内源木质纤维酶Bac‑to‑Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于白蚁内源木质纤维酶Bac‑to‑Bac重组杆状病毒的构建方法是按以下步骤进行的：一、参照GenBank中发表的黑翅土白蚁（Odontotermes forimosanus）的EG酶的基因序列，设计引物P1和P2，以黑翅土白蚁cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，并与pMD18‑T载体进行连接，获得p18EG1；二、用HindⅢ和EcoR Ⅰ对pFastBac1转移载体和步骤一获得的p18EG1分别进行双酶切，分别回收双酶切后的pFastBac1转移载体和双酶切得到的EG基因的目的条带，将回收的EG与pFastBac1进行连接，连接产物经鉴定后获得pFBEG1；三、将pFBEG1转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，以100ng重组Bacmid DNA为模板，以P1和P2为引物，进行PCR扩增，将含有F基因的重组Bacmid命名为Bacmid‑EG；四、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid‑EG转染sf9细胞，获得重组杆状病毒BVEG1，即完成白蚁内源木质纤维酶Bac‑to‑Bac表达载体的构建；其中，步骤一和步骤三中所述的引物P1序列均为5’‑ACATTCCACTTCAGAAGACGTC‑3’；引物P2为5’‑TGCAGAGGACGAATTCCTTTA‑3’。