[发明专利]白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库的构建方法

摘要

本发明公开了白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库的构建方法，该方法包括样品处理，总RNA提取、mRNA纯化、试验方和驱动子的抑制差减杂交及PCR扩增，抑制PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化、单克隆的保存等。本发明方法所构建的白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库灵敏度高，通过了目标片段的富集作用可以确保受白叶枯病菌胁迫后低丰度表达的cDNA被检测到；该文库插入片段平均长度450bp，可一次快速获得大量普通野生稻受白叶枯病菌胁迫的差异表达ESTs，为分离克隆抗白叶枯病相关基因的全长cDNA序列提供部分序列信息，同时为生物的改良等提供了重要的理论依据；可以获得新的抗白叶枯病相关基因。

主权项

白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库构建方法，包括以下步骤：（1）普通野生稻叶片材料的接菌处理  ①将白叶枯病菌菌株，划线于NA培养基平板上，28℃培养2‑3 d进行活化，活化后用无菌蒸馏水洗下菌苔，麦法兰分度计比浊法配制成6×108· ml‑1的菌液；②用沾取了菌液的剪刀从叶尖减去2‑3 cm的剪叶接种法接种白叶枯病菌于26‑28℃温室中的普通野生稻叶片，每个菌株接3墩，30片叶子，对照以无菌水代替菌液接种普通野生稻叶片作为对照；③接菌后每隔24 h，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h等量取样，对接无菌水的对照组也同时分别等量取样；④将接菌后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h收集到的6个阶段的普通野生稻叶片进行混合，作为试验方，对照无菌水接种的6个阶段的叶片也同样进行混合，作为驱动子；（2）总RNA 的提取①分别取试验方普通野生稻叶片和驱动子普通野生稻叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100 mg样品加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15 s混匀；②在15‑30℃放置5 min，加入200 μl氯仿，每使用1 ml TRIzol加入200 μl氯仿，盖好管带，涡旋振荡15 s，15‑30℃放置3 min；③4℃，12000 rpm离心15 min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中；④向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，15‑30℃放置20‑30 min；4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清；⑤加入DEPC水配制的体积分数为75%的乙醇溶液洗涤沉淀，每使用1 ml TRIzol用1ml DEPC水配制的体积分数为75%的乙醇溶液；⑥4℃，5000 rpm离心3 min；用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀；15‑30℃晾干2‑3 min，加入30‑100 μl无RNase双蒸水，充分溶解RNA后，‑70℃保存或进入下一步试验；（3）mRNA的纯化①5 mg Oligo(dT) Cellulose，加0.5 ml1×Binding Buffer，混匀，15‑30℃，2000 g离心2 min，去上清；②总RNA 0.3 mg，不足500 μl体积的用DEPC‑ddH2O补足，加入等体积的2×Binding Buffer，混匀；③将步骤（3）②中的混合液加入到步骤（3）①Oligo(dT) Cellulose中充分混匀，65 ℃水浴5 min，间或颠倒混匀；15‑30℃放置30 min，间或轻轻颠倒混匀，18～22℃，2000 g离心3 min，弃上清；④向mRNA‑ Oligo(dT) Cellulose mix中加入0.5 ml 1×Binding Buffer，混匀；15‑30℃，2000 g离心3 min，弃上清，重复该步骤一次；⑤加入0.5 ml Wash Buffer，混匀；15‑30℃，2000 g离心3 min，弃上清，重复该步骤一次；⑥加入200 μl 65℃RNA Elution，15‑30℃，4000 g离心3 min，收集上清，重复该步骤1‑2次；⑦加入等体积的异丙醇和1.6%的LAP，充分混匀，4℃，12000 g离心20 min，弃上清；加入700 μl 70%的乙醇洗涤，4℃，12000 g离心5 min；⑧晾干沉淀，30‑50 μl DEPC‑ddH2O溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测（4）试验方cDNA和驱动子cDNA的抑制差减杂交①利用反转录酶分别将试验方 mRNA 和驱动子 mRNA反转录成试验方 r和驱动子第二链cDNA；②分别在试验方和驱动子第二链cDNA反应管中加入RsaI酶，37℃酶切1.5 h；③RsaI酶切后的试验方cDNA与接头16℃连接过夜；④连接了接头的试验方cDNA与RsaI酶切的驱动子cDNA进行差减杂交，杂交完成后加入200 μl dilution buffer稀释杂交液，置于‑20℃保存或进行下一轮试验；（5）白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库的形成①以上一轮的稀释的杂交液作为模板，进行第一次PCR扩增，然后再以第二次PCR反应液作为模板进行第二轮的PCR扩增，具体反应体系和反应程序如下：第一次PCR：反应体系：10×PCR reaction buffer 2.5 μl，dNTP Mix(10μM) 0.5 μl，PCR Primer(10μM) 1μl，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μl，1μl稀释的杂交液模板，双蒸水不足25 μl；PCR反应程序：75℃ 5 min；94℃ 30 sec，66℃ 30 sec，72℃ 90 sec，27个循环；第二次PCR：反应体系：取1 μl第一次PCR反应液作为模板，10×PCR reaction buffer 2.5 μl，dNTP Mix (10 mM) 0.5 μl，Neasted Primer 1 (10 μM) 1 μl，Neasted Primer 2 (10 μM) 1 μl，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μl，双蒸水补足25；反应程序：94℃ 30 sec，68℃ 30 sec，72℃ 90 sec，27个循环；②将第二次PCR扩增得到的PCR产物与pMD18‑T载体连接，16℃连接过夜；③将连接产物通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于添加了AMP、IPTG、X‑gal的LB平板上，37℃过夜培养，进行蓝白班筛选；④从上述平板上挑取白色单克隆进行保存，即构建成所述的白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库。