[发明专利]基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种皮尔瑞俄类芽孢杆菌的基因工程菌、该工程菌的构建方法及其应用。本发明以皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH‑B‑1菌株为宿主菌，经过构建基因重组整合载体，构建带有P43强启动子调控下的透明颤菌血红蛋白基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39。本发明的基因工程菌可在胞内表达透明颤菌血红蛋白，提高皮尔瑞俄类芽孢杆菌对氧的利用率、细胞生物量及催化产物多肽类抗生素的产量，工程菌株的多肽类抗生素产量比原始菌株提高45％，为解决皮尔瑞俄类芽孢杆菌在细胞培养和催化过程中的供氧不足问题提供一条有效的途径。

主权项

一种基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：将来自于透明颤菌血红蛋白基因vgb，构建重组整合载体pIB139‑P43‑vgb；通过基因重组整合载体pIB139‑P43‑vgb中含有attP整合位点，将‑P43‑vgb‑片段整合到皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH‑B‑1的染色体上，获得了基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌，方法包括以下具体步骤：(1)PCR扩增P43启动子以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以P43‑F/P43‑R为引物，扩增P43启动子，其中，P43‑F：CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTCGCTTG；P43‑R：GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTTT；(2)PCR扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb以质粒pRK404‑VHb以模板，Vgb‑F/Vgb‑R为引物，扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb；其中vgb‑F：TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGGCTGGATCCTACCA；vgb‑R：CGGAATTAGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC；(3)重叠延伸拼接P43启动子和vgb用PCR回收试剂盒回收再次PCR的产物，并以步骤(1)和(2)的回收产物为模板，以P43‑F/Vgb‑R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增融合基因；(4)基因重组整合载体pIB139‑P43‑vgb的构建用PCR回收试剂盒回收步骤(3)的重叠PCR产物，将回收产物连接到pSET152衍生质粒pIB139上，连接体系为4μlPCR产物，5μlSolutionⅠ，1μl pIB139载体，16℃连接过夜，连接产物取5μl用来转化E.coli DH10B感受态细胞，加1ml的无抗LB，放入37℃的摇床预培养1h,取预培养后的菌液放入新的ep管中，加入300ul无抗LB，涂布于含有红霉性抗性的LB平板上37℃培养，次日挑选抗性斑划线；(5)基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌工程菌BC39的构建制备皮尔瑞俄类芽孢杆菌LXH‑B‑1感受态细胞；用BamHⅠ将基因重组整合载体pIB139‑P43‑vgb线性化，切胶回收，随后将100ng DNA加入200μl感受态中，孵育20min；加入LB和红霉素，培养90min，然后涂布红霉素抗性平板，37℃倒置培养12‑16h；挑选抗性菌落，划线到另一个平板；从红霉素平板上挑取转化子，然后在另一个平板上划线培养，同时挑取一部分菌株做Southern杂交，以研究vgb表达框是否真正整合到皮尔瑞 俄类芽孢杆菌LXH‑B‑1的染色体上，采用整合质粒pSET152上的ΦC31attp位点约2.3kb的片段作为探针，与接合子总DNA经BamHⅠ酶切的片段杂交分析鉴定接合子是否完成接合转移。