[发明专利]靶向GPMV NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备

摘要

本发明是一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：先对鹅源副粘病毒NA-1株NP、M基因的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对保守区的siRNA；将siRNA克隆到慢病毒表达质粒pLKD-EGFP后，再与pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，然后将其转导入靶细胞，使其在细胞内稳定表达，发挥抗病毒效应。本发明因其高效的转导率及严格的控制体系可以真实的评价siRNA在体内的抗病毒作用，可为禽类动物分子抗病育种奠定分子生物学基础；同时为新城疫等动物源性病毒病的防治提供新的途径。

主权项

一种靶向鹅源副粘病毒NA‑1株NP、M基因shRNA 的重组慢病毒的制备方法，其特征在于：首先分别设计针对鹅源副粘病毒NA‑1株NP、M基因的siRNA干扰序列，然后将其连接到酶切后的慢病毒载体的多克隆位点处，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒与其他2个慢病毒包装系统中的辅助质粒共转染293T细胞，进行重组慢病毒的包装；包装后测定该重组慢病毒的滴度；将滴度较高的重组慢病毒感染293T细胞或vero细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下：1) 根据GeneBank上GPMV NA‑1 株NP、M基因序列及Ambion公司网站设计siRNA干扰序列；2）shRNA序列与pLKD‑EGFP载体连接，转化，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR及测序鉴定结果显示该重组慢病毒重组载体构建成功；3）慢病毒包装及其滴度测定；4）将重组慢病毒感染vero细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并提取细胞基因组DNA，通过PCR方法检测EGFP基因序列。