[发明专利]ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株及其构建方法

摘要

本发明公开了一种ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法，具体是将SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列片段，插入含GFP绿色荧光的pRNAT-U6.1/Neo表达载体，再转入SMMC-7721细胞株，在SMMC-7721细胞中表达shRNA，经阳性细胞克隆筛选后，得到SMMC-7721/Sh36细胞株，使得siRNA靶向沉默了内源性ERα36的表达量30％以上，且95％以上的细胞表达绿色荧光蛋白的稳定转染细胞。这一细胞模型可用于研究ERα36与肝癌的相关性及其机理；也可用于研究雌激素在肝癌细胞中的信号传导通路；及作为研究雌激素的膜受体信号通路的细胞模型。

主权项

ERα36缺陷型SMMC‑7721稳定转染细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)设计对应ER‑α36基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；(b)构建含有上述碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT‑U6.1/Neo重组质粒；(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC‑7721得到的重组细胞株；(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性克隆细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI‑1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法，和/或细胞计数法，和/或软琼脂糖集落形成实验法检测。