[发明专利]一种分离培养多种病毒的方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种分离培养多种病毒的方法。尤其是用于分离培养多种病毒的MHV混合细胞液氮保存方法；本方法中，采用MEM冻存液，通过T75细胞瓶制备混合细胞MHV单层细胞，经EDTA-胰酶消化，直接悬浮于冷冻保存液中，在液氮中保存4个月后，细胞复苏后存活率达到99.20％～99.60％。本发明方法能克服现有技术中MHV混和细胞在分离培养多种病毒时的缺陷，可为临床病毒性疾病的快速诊断、实验室病毒性监测中多种病毒病原的分离培养提供切实的可操作性，尤其适用于呼吸道流感病毒、腺病毒和人肠道病毒EV71分离培养。能解决目前传染性疾病爆发疫情的公共卫生应急的需求，和临床实验室的病毒性传染性疾病的检测。

主权项

一种分离培养多种病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：(1)制备冷冻保存液：所述的冷冻保存液为含20％胎牛血清、8％DMSO的MEM混合细胞冻存液；(2)制备MHV混合细胞冷冻保存管：将MDCK、HEp‑2、Vero三株细胞系分别在T75细胞瓶中长成单层细胞后经EDTA‑胰酶消化，加入步骤(1)的冷冻保存液悬浮细胞，分别对所述的细胞悬液计数后混合，制成细胞数为1×106/ml的细胞悬液，其中，每株细胞的细胞数分别为3.33×105/ml；分装至冷冻保存管；(3)冷冻程序：将上述冷冻保存管置程序冷冻盒内，入‑80℃冰箱，冷冻24h后，冻存管置入液氮罐抽屉中，液氮保存不同时间；(4)液氮冻存的MHV细胞复苏和计数：取上述冻存的MHV混合细胞管，37℃水浴溶解复苏，低速离心，弃上清，用含5％胎牛血清MEM生长液重悬细胞沉淀，并吸入灭菌细胞瓶，染色后在显微镜下活细胞计数；(5)制备MHV混合细胞板：将上述复苏的混合细胞悬液分装24孔培养板中，置37℃、5％CO2温箱中培养，24h、48h分别在倒置显微镜观察MHV混合细胞汇合形态、铺满单层百分率；(6)分离培养多种病毒取步骤(5)的复苏的MHV混合细胞制备的细胞培养板分离培养多种病毒。